文/ Stefan Vossk?tter

數(shù)字化技術(shù)沒有在HPLC高效液相色譜技術(shù)面前停下自己的腳步// 對當(dāng)前數(shù)字化技術(shù)在這一領(lǐng)域中發(fā)展?fàn)顩r的初步研究，就已經(jīng)清楚的看到HPLC領(lǐng)域中的數(shù)字化明顯的減少了出現(xiàn)錯誤的可能性并大幅度地提高了實(shí)驗室的工作效率。但從成本費(fèi)用的角度來看，即使從長遠(yuǎn)發(fā)展的角度來看還有許多地方無法完全自動化。

幾十年來，HPLC高效液相色譜法一直是定量分析和鑒定未知混合物成分的成熟技術(shù)。與MS質(zhì)譜等檢測技術(shù)相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)更低的檢測極限。同樣，它也有著很強(qiáng)的檢測能力。將HPLC高效液相色譜法視為一種慢速檢測分離方法的時代已經(jīng)過去了，每小時的檢測能力有了大幅度的提高，硬件技術(shù)的不斷發(fā)展，色譜柱使用的材料有了很大的進(jìn)步。像使用的SFC CO2超臨界流體色譜法等最新的研發(fā)成果也一直被視為高效液相色譜分離技術(shù)的補(bǔ)充和替代技術(shù)。如果統(tǒng)一的將HPLC視為一種液體—固體色譜技術(shù)，那么從經(jīng)濟(jì)性/技術(shù)的角度來看，在某些應(yīng)用領(lǐng)域中像GPC凝膠滲透色譜法、2D-HPLC二維液相色譜法或者離子色譜法等分離技術(shù)將不能被稱之為替代技術(shù)方案了。

向何方發(fā)展？

人們會想：HPLC高效液相色譜法的進(jìn)一步發(fā)展是向著更高的工作壓力方向發(fā)展的，就像UHPLC超高壓液相色譜技術(shù)那樣，但實(shí)際發(fā)展的情況卻不是這樣。原因有下面幾個：

需要時間更短的應(yīng)用場合非常少；

隨著壓力的提高，對所使用的材料的要求也在提高，需要更短的色譜儀維護(hù)保養(yǎng)時間和更高的色譜儀流量。

這與實(shí)驗室4.0、智能實(shí)驗室或者Futurlab NRW未來實(shí)驗室等理念背道而馳。其中，數(shù)字化技術(shù)有著非常重要的意義和作用，也是色譜法技術(shù)、實(shí)驗室內(nèi)部流程優(yōu)化、新的標(biāo)準(zhǔn)工作程序以及實(shí)驗硬件發(fā)展的前提。

數(shù)字化的一個實(shí)例

數(shù)字化并不是新的發(fā)展趨勢。例如制藥業(yè)的實(shí)際例子就充分說明了這一點(diǎn)。很久以前在建立完成的實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)工作流程時就提出了合適的軟件解決方案。支持?jǐn)?shù)據(jù)庫的軟件系統(tǒng)給制藥界帶來了ALCOA格式的文件，同時也為建立連接和自動化流程奠定了基礎(chǔ)。新的藥物活性成分的開發(fā)流程就充分說明了這一點(diǎn)。

在需要篩選的物質(zhì)種類繁多時就需要自動化的篩選分離了。合成物質(zhì)的純化是自動化的，并且是按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行的。盡管這種標(biāo)準(zhǔn)化的工作流程使色譜分離的各個環(huán)節(jié)清晰可見，但大多數(shù)實(shí)驗室的色譜技術(shù)解決方案都是“各有特色的”，不能1∶1的從一個實(shí)驗室轉(zhuǎn)移到另一個實(shí)驗室。要想使實(shí)驗室自動化能夠繼續(xù)下去，就必須讓實(shí)驗室自動化有足夠的靈活性。而嚴(yán)格的監(jiān)管法規(guī)也必然要求未來的檢測實(shí)驗室和其他研發(fā)機(jī)構(gòu)想方設(shè)法保持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性。這正是整合現(xiàn)有不同自動化技術(shù)形式并使現(xiàn)有實(shí)驗室工作流程更加可持續(xù)的、經(jīng)濟(jì)的和高效發(fā)展的好機(jī)會。

借用工業(yè)領(lǐng)域中的術(shù)語“工業(yè)4.0”、第四次工業(yè)革命，實(shí)驗室領(lǐng)域中出現(xiàn)了以“實(shí)驗室4.0”表示完全網(wǎng)絡(luò)化、自我控制、自我調(diào)節(jié)和自我優(yōu)化的概念。在不久的將來，“實(shí)驗室4.0”的理念還不能全部實(shí)現(xiàn)，原因是很高的投資費(fèi)用使一些實(shí)驗室不堪重負(fù)。但實(shí)驗室現(xiàn)有的解決方案結(jié)合使用標(biāo)準(zhǔn)的CDS色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)就有可能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗室自動化，對實(shí)驗室自動化給予有力的支持和幫助。它提供了避免典型錯誤的功能，提供了可重復(fù)使用且易于評判的新算法。

我們怎么樣？

仔細(xì)的觀察每一個實(shí)驗室后就會發(fā)現(xiàn)：沒有兩個實(shí)驗室是完全一樣的。當(dāng)需要測試的樣本量很小時，實(shí)驗室通常都會使用傳統(tǒng)的軟件解決方案甚至是手動進(jìn)行檢測分析和評估。在中型實(shí)驗室中，通常情況下基于數(shù)據(jù)庫的CDS色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)已經(jīng)基本到位，可以確保數(shù)據(jù)的可追溯性、處理大流量的數(shù)據(jù)。還有一些實(shí)驗室已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動化。它們現(xiàn)有的任務(wù)就是內(nèi)部開發(fā)并專注于解決特殊應(yīng)用問題。

有些使用的實(shí)驗分析技術(shù)已經(jīng)非常陳舊了，沒有時間對實(shí)驗室工作流程進(jìn)行優(yōu)化或者開發(fā)新的實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)工作流程。規(guī)定了某個專用方法的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)或者技術(shù)規(guī)范可能是實(shí)驗室技術(shù)老化的另一個原因。HPLC高效液相色譜技術(shù)分離不同組成成分的能力比以往任何分離技術(shù)都強(qiáng)。從擁有極微小顆粒物的固體相到分離單一特種材料直至在混合物中各種成分的分離，幾乎都可以使用HPLC高效液相色譜技術(shù)，而且分離的結(jié)果也達(dá)到了當(dāng)代最先進(jìn)水平。而且在提供新系統(tǒng)時還附有色譜柱或者系統(tǒng)生產(chǎn)廠家的使用說明書。通常情況下，新開發(fā)的色譜技術(shù)方法更加穩(wěn)健、可靠和經(jīng)濟(jì)，這也是大多數(shù)情況下優(yōu)化實(shí)驗室的工作流程是非常值得一做的原因了。

軟件和硬件

許多CDS系統(tǒng)和HPLC系統(tǒng)已經(jīng)為色譜分析過程的自動化提供了有趣的軟件和硬件。在儀器設(shè)備制造商的研發(fā)過程中，他們常常關(guān)注色譜技術(shù)應(yīng)用的全過程（見圖1）。例如，Shimadzu分析技術(shù)公司。從樣本制備開始，可以在自動進(jìn)樣器中完成一些簡單的稀釋過程。例如在氨基酸檢測分析之前，可以使用較少的樣本量，得到更好的重復(fù)再現(xiàn)性和很高的自動化程度。有些低濃度的分析物需要先富集，這時，自動化的在線SPE固相萃取可以顯著提高檢測的極限值。

圖1 采用智能分析技術(shù)的UHPLC超高效液相色譜分析流程

檢測分析過程中，輔助系統(tǒng)有助于避免出現(xiàn)典型的錯誤。輔助系統(tǒng)會自動的監(jiān)測所用溶劑液位的高低，并在溶劑液位到臨界值時自動的停止檢測分析以避免色譜柱干涸和損壞（見圖2）。在啟動HPLC高效液相色譜系統(tǒng)時，輔助系統(tǒng)會自動的監(jiān)測流量和壓力，并根據(jù)色譜柱柱溫緩慢的調(diào)整到最大值。這能有效的避免損壞色譜柱底部的壓力峰值。如果探測到氣泡，輔助系統(tǒng)會自動切斷檢測分析過程。在恢復(fù)檢測分析之前，輔助系統(tǒng)會自動的沖洗流路并檢查流路的狀態(tài)。

圖2 A）Nexera UHPLC系列流動相檢測器（MPM）示意圖。B) 有三種狀態(tài)信號的MPM流動相檢測器軟件

分離技術(shù)

分離柱是HPLC高效液相色譜法系統(tǒng)的核心部件。因此，觀察分離柱的狀態(tài)、記錄向分離柱進(jìn)樣的次數(shù)是非常重要的工作。根據(jù)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，例如進(jìn)樣次數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解度或者背壓，可以分析判斷分離柱的工作狀態(tài)，必要時更換分離柱。在專用接口的幫助下，色譜柱恒溫器可以自動識別系統(tǒng)中安裝了什么分離柱，并把它們的狀態(tài)數(shù)據(jù)保存在數(shù)字格式的工作日志中。

數(shù)據(jù)分析評判和分析評判技術(shù)

檢測分析之后就是評判數(shù)據(jù)。在有監(jiān)管要求的特殊環(huán)境中有著一些很高的要求。因為這時要求自動完成色譜峰的積分和含量計算，此時已不可能再進(jìn)行人工干預(yù)了。因此，現(xiàn)在已經(jīng)有許多可重復(fù)再現(xiàn)的和自動化的數(shù)據(jù)評估解決方案了，包括自動的生成檢測分析報告。

新的算法實(shí)現(xiàn)了以前只有人工操作才能解決的問題。例如使用二極管陣列檢測器可以明顯增大校準(zhǔn)的線性范圍。非基線分離的峰可以通過自動峰解卷積基線分離和量化（見圖3）。系統(tǒng)性能測試、QA/QC品質(zhì)保證和品質(zhì)控制的檢查或者基線修正都可以在測量過程中自動的進(jìn)行。如果檢測的結(jié)果不能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求就會自動停止色譜檢測分析。

圖3 A）甲基苯乙酮的位置異構(gòu)體；B）o-MAP鄰甲基苯乙酮、m-MAP間甲基苯乙酮和 p-MAP對甲基苯乙酮混合物部分分離的色譜峰；C) p-MAP對甲基苯乙酮中的污垢標(biāo)準(zhǔn)

維護(hù)保養(yǎng)

今天，借助于智能服務(wù)網(wǎng)絡(luò)可以自動監(jiān)視HPLC高效液相色譜系統(tǒng)的工作情況、做好它們的維護(hù)保養(yǎng)計劃。智能服務(wù)網(wǎng)絡(luò)跟蹤HPLC系統(tǒng)的工作狀況并預(yù)測其易損件的使用壽命，這也就能夠前瞻性的做好維護(hù)保養(yǎng)計劃。系統(tǒng)所出現(xiàn)的錯誤都被集中起來，事先授權(quán)售后服務(wù)人員訪問智能服務(wù)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)利，以便他們可以根據(jù)智能服務(wù)網(wǎng)絡(luò)匯總的錯誤做出初步的分析判斷、給出解決問題的建議和意見或者訂購維護(hù)保養(yǎng)所需的材料。

小結(jié)

未來的HPLC高效液相色譜實(shí)驗室是什么樣子的？無論工業(yè)領(lǐng)域如何發(fā)展，HPLC的未來似乎都將保持多元化和專業(yè)化，但比以前更加智能化。過去幾年的發(fā)展歷史表明：HPLC高效液相色譜技術(shù)絕不是一種過時的分離技術(shù)。這一領(lǐng)域中的大多數(shù)技術(shù)創(chuàng)新都集中在友好的用戶操作體驗、簡單實(shí)驗操作過程的自動化和新的輔助支持系統(tǒng)等方面。盡管像質(zhì)譜技術(shù)或者新的SFC固相萃取技術(shù)層出不窮，但HPLC高效液相色譜技術(shù)仍然會在未來伴隨您左右。僅從經(jīng)濟(jì)性角度來看，它將是小型實(shí)驗室或者樣本量很少時的標(biāo)準(zhǔn)解決方案。在中小型實(shí)驗室中，簡單實(shí)驗分析流程的自動化或者輔助系統(tǒng)將會茁壯成長，例如它們可以使用自動化的樣本制備，或者通過輔助支持系統(tǒng)避免出現(xiàn)典型的檢測分析錯誤。 ■