周孟焦，何鑫柱，陳凱，康明，梁曉峰

（1.西南科技大學材料科學與工程學院，四川綿陽621010；2.四川中醫(yī)藥高等?？茖W校川西北中藥材資源研究與開發(fā)利用實驗室，四川綿陽621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC）飲片具有溫中止痛，殺蟲止癢等功效，可用于治療脘腹冷痛，嘔吐泄瀉，蟲積腹痛和濕疹瘙癢[1-4]。研究表明，竹葉花椒果皮富含的天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗腫瘤、免疫調節(jié)等多種生理活性[5-6]，從竹葉花椒中提取天然黃酮類化合物有助于提高其藥用價值。

黃酮類化合物結構豐富多樣，其提取、分離、純化工藝條件與其來源有密切關系。目前常用的提取方法主要有水煎煮法、常規(guī)有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[7-8]，但這些方法存在提取效率低、提取時間長、超聲波衰減、設備價格高等不足的問題。微波輔助提取法是利用微波和傳統(tǒng)溶劑萃取相結合，能夠在短時間內穿透樣品和樣品內部，并通過偶極子旋轉和離子電導率提高萃取率，廣泛應用于黃酮類物質的提取[9-10]。聚酰胺和大孔吸附樹脂是純化黃酮類物質常用的吸附劑，二者吸附原理不同，實際中單獨使用較多，將聚酰胺和大孔吸附樹脂聯(lián)用可充分發(fā)揮兩者優(yōu)勢，提高純化效率[11-12]。

本研究以蘆丁為對照品，利用分光光度法測定樣品的總黃酮含量。系統(tǒng)地研究了利用微波輔助法從竹葉花椒中提取總黃酮的工藝參數(shù)。在此基礎上，考察洗脫液和吸附劑對總黃酮富集純化效果的影響，以期獲得便捷高效的提取純化方法，為竹葉花椒總黃酮的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮竹葉花椒：采自四川省漢源藤椒種植基地，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等專科學校江洪波副教授鑒定為蕓香科花椒屬植物竹葉花椒；蘆?。ǚ治黾儯荷虾０⒗∩萍脊煞萦邢薰荆淮罂孜綐渲珼101：成都市科隆化學品有限公司；聚酰胺（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XH-MC-1型實驗室微波合成儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；BSA124S型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV-315型紫外可見分光光度計：日本島津公司；TG-18型離心機：四川蜀科儀器有限公司；RE52CS-2型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 竹葉花椒總黃酮提取

挑選大小均勻無損傷的新鮮竹葉花椒果皮，去除果柄，恒溫40℃烘烤24 h，得干燥竹葉花椒果皮，保存待用。稱取1.0 g干燥竹葉花椒果皮，以乙醇為溶劑，放入微波反應器中，設定微波輔助提取條件。粗提液抽濾，濾液在25℃下以3 500 r/min離心10 min，用提取溶劑定容。提取液用石油醚萃取以除去脂溶性雜質，取下層溶液，即得竹葉花椒總黃酮粗提液。

1.3.2 標準曲線繪制

精確稱取蘆丁標準品20 mg，無水乙醇溶解后轉移至100 mL容量瓶中，以無水乙醇定容，配制成濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

精確量取 0.2 mg/mL 的蘆丁溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于7支干凈試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min，加10%氫氧化鈉溶液5 mL，再加無水乙醇補齊至10 mL，搖勻，放置15 min。顯色穩(wěn)定后，分別測定標準溶液在510nm處的吸光度[13]。以蘆丁標準溶液質量濃度（mg/mL）為橫坐標，相應吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到蘆丁濃度x與吸光度Y的關系曲線的回歸方程為Y=0.79x+0.001 57，R2=0.999 6。

1.3.3 總黃酮含量及得率的測定

根據(jù)1.3.2得到的標準曲線計算得到總黃酮含量，并按下式計算總黃酮得率。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 乙醇體積分數(shù)對竹葉花椒總黃酮得率的影響

以干燥竹葉花椒果皮為原料，固定料液比為1∶30（g/mL），微波功率 300 W，提取溫度 70℃，提取時間20 min，分別以體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為溶劑提取黃酮，比較不同乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響。

1.3.4.2 料液比對竹葉花椒總黃酮得率的影響

以干燥竹葉花椒果皮為原料，固定乙醇體積分數(shù)60%，微波功率300W，提取溫度70℃，提取時間20min，分別設定料液比為 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），比較不同料液比對總黃酮得率的影響。

1.3.4.3 微波功率對竹葉花椒總黃酮得率的影響

以干燥竹葉花椒果皮為原料，固定乙醇體積分數(shù)60%，料液比 1∶30（g/mL），提取溫度 70 ℃，提取時間20 min，分別以 200、300、400、500、600 W 的微波功率進行提取，比較不同微波功率對得率的影響。

1.3.4.4 提取溫度對竹葉花椒總黃酮得率的影響

以干燥竹葉花椒果皮為原料，固定乙醇體積分數(shù)為 60%，料液比 1∶30（g/mL），微波功率 300 W，提取時間 20 min，分別以 50、60、70、80、90 ℃的提取溫度進行提取，比較不同提取溫度對總黃酮得率的影響。

1.3.4.5 提取時間對竹葉花椒總黃酮得率的影響

以干燥竹葉花椒果皮為原料，固定乙醇體積分數(shù)60%，料液比 1∶30（g/mL），微波功率 300 W，提取溫度70 ℃，分別設定提取時間為 15、20、25、30、35 min 進行提取，比較不同提取時間對總黃酮得率的影響。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗研究基礎上，進行五因素四水平正交試驗，以竹葉花椒總黃酮得率為考察指標，試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 The experimental factors and levels of orthogonal test

1.3.6 黃酮富集純化試驗

1.3.6.1 聚酰胺純化

取適量聚酰胺，按參考文獻[14]中的方法對聚酰胺進行預處理，備用。精確量取10 mL粗提液，拌入2.0 g干燥聚酰胺，揮去溶劑后，依次用水及體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液5 BV，將洗脫液干燥后稱重，得到洗脫液中含有的固體量。同時，通過測定洗脫液中總黃酮含量，按下式計算總黃酮的純度和收率。

1.3.6.2 大孔吸附樹脂純化

取適量大孔吸附樹脂，按參考文獻[14]中的方法對大孔吸附樹脂進行預處理，備用。精確量取10 mL粗提液，置于預先以水為溶劑填充的D-101大孔樹脂層析柱上部，先以水洗至流出液近無色，后依次用體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液5 BV，測定洗脫液中固體含量和總黃酮含量，按1.3.6.1中方法計算總黃酮的純度和收率。

1.3.6.3 聚酰胺-大孔吸附樹脂純化

精確量取10 mL粗提液與2.0 g聚酰胺混合，揮去溶劑后置于預先以水為溶劑填充的D-101大孔樹脂層析柱上部，先以水洗至流出液近無色，后依次用體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液5 BV，測定洗脫液中所含的固體量和總黃酮的量，按1.3.6.1中方法計算總黃酮的純度和收率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

各因素對總黃酮得率的影響見表2。

表2 單因素試驗結果Table 2 The results of single-factor experiment

由表2可知，乙醇體積分數(shù)為50%、料液比為1∶30（g/mL）、微波功率 400 W、提取溫度 80℃、提取時間25 min時，總黃酮得率均為不同水平中的最大值，分別為8.791 3%、8.804 4%、8.983 8%、9.051 9%、8.941 3%。故單因素試驗確定的最優(yōu)試驗條件為乙醇體積分數(shù)50%、料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 400 W、提取溫度80℃、提取時間25 min。

2.2 正交試驗結果

通過試驗得出正交試驗結果及極差分析見表3，正交試驗方差分析見表4。

表3 正交試驗結果及極差分析Table 3 The results of orthogonal experiment

續(xù)表3 正交試驗結果及極差分析Continue table 3 The results of orthogonal experiment

表4 正交試驗方差分析Table 4 The variance analysis of orthogonal experiment

由表3的極差分析可知，微波功率對得率的影響最大，各因素對竹葉花椒總黃酮提取效果的影響的主次順序為微波功率＞提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞料液比。表4方差分析表明，C（微波功率）、D（提取溫度）和E（提取時間）對總黃酮得率有顯著影響（P＜0.05），根據(jù)k值確定微波輔助提取竹葉花椒總黃酮的最優(yōu)提取條件為A3B3C2D3E3，即乙醇體積分數(shù)60%，料液比 1∶30（g/mL），微波功率 400 W，提取溫度 80℃，提取時間25 min。進行3次驗證試驗，得到總黃酮平均得率為9.20%，結果高于正交試驗各組的總黃酮得率。

2.3 總黃酮的分離和純化

2.3.1 聚酰胺樹脂洗脫分析

以干燥聚酰胺為吸附劑，對總黃酮的收率和純度進行測定，結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對聚酰胺樹脂洗脫的影響Fig.1 The effect of ethanol volume fraction on the elution of polyamide resin

由圖1可知，在水洗液和乙醇體積分數(shù)為20%的洗脫液中，總黃酮收率相對較低，而乙醇體積分數(shù)為40%～80%的洗脫液中的總黃酮收率和純度均較高，其中經(jīng)60%乙醇洗脫純化后，收率為35.13%，純度為37.14%，具有較好的富集純化作用，故選擇體積分數(shù)為60%的乙醇為聚酰胺樹脂純化的洗脫溶劑。

2.3.2 大孔吸附樹脂洗脫分析

以D-101大孔樹脂層析柱為吸附劑，對總黃酮的收率和純度進行測定，結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對大孔吸附樹脂洗脫的影響Fig.2 The effect of ethanol volume fraction on the elution of macroporous resin

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，洗脫液中的總黃酮收率和純度均增高，其中經(jīng)60%乙醇洗脫純化后，收率為31.46%，純度為32.55%，乙醇體積分數(shù)再增加洗脫液中總黃酮收率和純度反而有所降低，可能是因為乙醇體積分數(shù)越高，洗脫下來的雜質也隨之增多，故選擇體積分數(shù)為60%乙醇為大孔吸附樹脂純化的洗脫溶劑。

2.3.3 聚酰胺-大孔吸附樹脂洗脫分析

將兩種吸附劑聯(lián)用，對總黃酮的收率和純度進行測定，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對聚酰胺-大孔吸附樹脂洗脫的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on the elution of polyamide-macroporous resin

由圖3可知，樣品液經(jīng)水洗、聚酰胺樹脂初步純化后再經(jīng)過大孔吸附樹脂層析柱，乙醇體積分數(shù)為60%的洗脫液富集純化效果最佳，收率為43.50%，純度為42.54%，均高于單一吸附劑的吸附效果。先將粗提液以水為洗脫液除去生物堿和大量水溶性雜質，再利用聚酰胺和大孔吸附樹脂進行純化，可達到竹葉花椒總黃酮的初步富集純化。結合聚酰胺樹脂、大孔吸附樹脂純化工藝中的乙醇洗脫濃度的結果，選定體積分數(shù)為60%的乙醇作為洗脫劑。

3 結論

利用微波輔助提取竹葉花椒中總黃酮，試驗獲得的最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶30（g/mL），微波功率400 W，提取溫度80℃，提取時間25 min，總黃酮得率為9.20%。試驗確定了體積分數(shù)為60%乙醇為洗脫液，聚酰胺-大孔吸附樹脂為聯(lián)合吸附劑對提取物進行純化，總黃酮收率和純度分別為43.50%和42.54%，優(yōu)于單一吸附劑的吸附效果，試驗結果為竹葉花椒總黃酮的提取純化提供了試驗參考。