朱鵬飛，于春娣，唐娟，趙皓卿，丁秋嫻，楊慶利，趙海燕

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

茶葉在中國具有豐富的資源優(yōu)勢、文化底蘊和消費傳統(tǒng)，也是中國在國際市場具有較強競爭力的創(chuàng)匯商品[1]。茶文化已成為中國傳統(tǒng)文化的重要組成部分，隨著近年來大量有關(guān)喝茶有利人體健康的科學(xué)研究，國內(nèi)茶葉消費不斷增長[2]。茶鮮葉中的化學(xué)成分高達(dá)600余種[3]，除含有蛋白質(zhì)和氨基酸等有機化合物之外，還含有多種金屬元素，如 Na、Mg、K、Ca、Fe、Co、Cu、Zn、Mo等[4-5]。這些金屬元素會對人體健康造成一定的影響。因此，檢測并分析茶鮮葉中的金屬元素的含量，有著重要的意義與應(yīng)用價值[6]。

當(dāng)前，國內(nèi)外研究主要集中在茶葉中微量元素含量的分析[7-13]，利用礦物質(zhì)元素對茶葉進行產(chǎn)地溯源[14-18]以及對茶葉的真?zhèn)芜M行鑒定[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中微量元素含量與茶葉產(chǎn)地來源密切相關(guān)，不同產(chǎn)地種源土壤中微量元素含量是茶葉微量元素的主要來源之一[14]。受茶葉的化學(xué)組分及代謝的影響，不同品種間微量元素含量差異較大[20]。因不同季節(jié)的溫度、降水量和光照時間等有明顯差異，季節(jié)變化對茶葉微量元素含量也具有顯著影響[21-23]。目前鮮有對茶鮮葉中金屬元素含量影響因素及其交互作用的綜合探究。

對于茶葉中金屬元素含量的探究，通常采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）。ICP-MS 是一項常用技術(shù)，具有抗干擾、靈敏度高、多元素同時分析以及在復(fù)雜機體中能準(zhǔn)確分析痕量元素等特點[24]。本研究主要通過ICPMS 檢測茶鮮葉中的金屬元素 Na、Mg、K、Ca、Fe、Co、Cu、Zn和Mo的含量，分析茶鮮葉產(chǎn)地、品種以及收獲季節(jié)對金屬元素含量的影響，解析茶鮮葉中金屬元素與種源土壤相關(guān)元素含量間的關(guān)系，解析各影響因素對各元素含量變異的貢獻率，以期為研究茶鮮葉中的金屬元素含量提供理論基礎(chǔ)與科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉：分別于2016年的春季（3月）、夏季（6月）和秋季（9月）從青島市、合肥市和杭州市采集茶樹樹齡相同的樣品（安吉白茶、烏牛早茶、平陽特早茶），每份樣品在枝干末端采摘成熟度相似的第一葉葉片，采集約100 g。對每個地區(qū)每季的每個品種樣品各采摘3份，共收獲81份茶鮮葉樣品；土壤樣品：通過土鉆采集土壤樣品，以茶樹種植點為采樣中心，保證每個茶鮮葉樣品與其種源土壤對應(yīng)，采樣深度為0～20 cm，在每個采樣點用四分法采集土樣約250 g，共采集81份土樣。最終收集的所有樣品分類，標(biāo)注信息后保存在聚乙烯袋中備用。

硝酸（BV-III級）、過氧化氫（BV-III級）、高氯酸（BV-III級）、氟化氫（BV-III級）：北京化學(xué)試劑研究所；去離子水（電阻率18.2 MΩ·cm）：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院；茶葉標(biāo)準(zhǔn)物、土壤標(biāo)準(zhǔn)物、內(nèi)標(biāo)（72Ge、115In、209Bi）、外標(biāo)：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；DHG-9240A型恒溫干燥箱：北京中儀國科科技有限公司；DV4000型精確控溫電熱消解儀：北京安南科技有限公司；CEM Mars240/50微波消解儀：美國CEM公司；7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

1.3.1.1 茶鮮葉樣品預(yù)處理

用去離子水徹底清洗茶鮮葉，去除表面的雜質(zhì)污染，樣本在70℃下干燥12 h至恒重后，用研缽研磨成細(xì)粉，過100目篩網(wǎng)后放入聚乙烯袋中備檢。隨后進行微波消解，稱取茶鮮葉粉末0.250 0 g，放入25 mL聚四氟乙烯消解管中，加入6 mL的硝酸，蓋上蓋子，反應(yīng)1 h；再加入2 mL的過氧化氫，反應(yīng)30 min。放入微波消解儀中進行微波消解，在微波消解系統(tǒng)中逐步升高功率至1 600 W，溫度設(shè)置為180℃，消解時間40 min，按照消解程序設(shè)定步驟進行升溫消解。待消解結(jié)束后，將混合物置于電熱消解儀，以180℃的溫度蒸發(fā)至接近干燥，冷卻至室溫（25℃）后轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用超純水調(diào)節(jié)溶液至100 mL備用[25]。

1.3.1.2 土壤樣品預(yù)處理

土壤樣品室溫（25℃）干燥1周后，用2 mm的聚乙烯篩對土壤中的碎石、根等雜質(zhì)進行過濾，隨后將土壤樣品研磨成細(xì)粉，過100目篩后放入聚乙烯袋。對土壤樣品進行消解。稱取土壤樣品約0.250 0 g，放入微波消解管中，加入8mL硝酸和2mL氟化氫后放在消解儀中反應(yīng)。在微波消解系統(tǒng)中，功率增加至1600 W，溫度設(shè)定為120℃，消解時間10 min，按照步驟進行升溫消解。待消解結(jié)束后，將混合物置于電熱消解儀上進行趕酸，以180℃的溫度蒸發(fā)至接近干燥，冷卻至室溫（25℃）后轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用超純水定容至100 mL備用。

1.3.2 金屬元素含量檢測

利用ICP-MS測定茶鮮葉中的9種金屬元素（Na、Mg、K、Ca、Fe、Co、Cu、Zn 和 Mo）含量。參數(shù)如下：射頻功率1 280 W，載氣及輔助氣體流速1.0 L/min，等離子體氣體流速15 L/min，霧化室溫度2℃。以72Ge、115In、209Bi為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對每種樣品或標(biāo)準(zhǔn)物進行3次測定。當(dāng)內(nèi)標(biāo)相對標(biāo)準(zhǔn)差＞5%時，重新對樣品進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS 25.0軟件，對測定的茶鮮葉金屬元素含量進行化學(xué)計量學(xué)分析。分析采用單因素方差分析、多因素方差分析和Pearson相關(guān)分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確度分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的檢測結(jié)果，參照茶葉標(biāo)準(zhǔn)樣品和土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品，其回收率在91%～109%，標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，充分說明檢測結(jié)果真實可靠。

2.2 不同產(chǎn)地茶鮮葉中金屬元素含量的影響因素分析

2.2.1 不同產(chǎn)地茶鮮葉中金屬元素含量的變異分析

為研究產(chǎn)地對茶鮮葉中金屬元素含量的影響，將81份茶鮮葉樣品按產(chǎn)地劃分3類，不同產(chǎn)地茶鮮葉中的金屬元素含量見表1。

表1 不同產(chǎn)地茶鮮葉中金屬元素含量Table 1 The concentrations of metal elements in tea leaves from different origins

由表 1 可知，元素 Na、Ca、Fe、Co、Cu 和 Zn 的含量在3個產(chǎn)地間差異極顯著（P＜0.01），元素Mg和K含量在3個產(chǎn)地間存在差異顯著（P＜0.05），元素Mo含量在3個產(chǎn)地間差異不顯著。結(jié)果表明產(chǎn)地影響茶鮮葉中某些金屬元素的含量。聶晶等[26]研究發(fā)現(xiàn)山東省不同市茶葉中Mg、K、Ca、Fe、Cu和Zn含量均表現(xiàn)出一定的差異性；Ma等[27]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地茶葉中Na、Mg和Cu的含量存在顯著差異，這與本研究結(jié)果一致。

為探究3個產(chǎn)地兩兩之間茶鮮葉金屬元素含量的差異，進行了Duncan多重比較。結(jié)果表明，除元素Mo含量在不同產(chǎn)地間差異無顯著性外，其余元素（Na、Ca、Fe、Co、Cu、Zn、Mg 和 K）在兩兩地區(qū)茶鮮葉的比較中，元素含量具有各自的特征。青島市茶鮮葉中元素Ca的含量顯著高于其它兩市茶鮮葉（P＜0.05），而元素K、Fe、Cu和Zn含量要比合肥市和杭州市偏低。合肥市茶鮮葉中元素Na、Mg含量與青島市茶鮮葉無明顯差異且高于杭州市茶鮮葉中Na、Mg含量，K含量與杭州市茶鮮葉無明顯差異而顯著高于青島市茶鮮葉中K元素含量，F(xiàn)e元素含量在3個產(chǎn)地茶鮮葉中含量最高，Co元素含量與青島市茶鮮葉中Co元素含量無明顯差異且均顯著低于杭州市。杭州市茶鮮葉中，Co元素和Zn元素的含量顯著高于其它兩市，Na元素含量顯著低于其它兩市，Ca元素含量與合肥市茶鮮葉中Ca元素含量無顯著差異且低于青島市，Cu元素含量與合肥市無明顯差異而明顯高于青島市。

2.2.2 茶鮮葉中金屬元素與種源土壤中元素含量關(guān)系分析

為進一步探究造成不同產(chǎn)地間金屬元素含量差異的原因，本研究對種源土壤中元素含量進行關(guān)系分析，對不同產(chǎn)地81份種源土壤中的9種金屬元素含量進行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 不同種源土壤中金屬元素含量Table 2 The concentrations of metal elements in provenance soils from different regions

由表2可知，不同產(chǎn)地種源土壤中不同金屬元素含量均呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。表明種源土壤金屬元素含量受產(chǎn)地的影響較為明顯。對土壤金屬元素含量進行Duncan多重比較，結(jié)果表明，在青島市種源土壤中，Na、Mg、K和Ca元素含量顯著高于其它兩地；合肥市土壤中Fe元素和Co元素含量高于其它兩地且差異顯著；杭州市土壤中Cu元素含量顯著高于青島市和合肥市（P＜0.05），而元素Zn和Mo含量與青島市差異不顯著但均高于合肥市。

為進一步了解茶鮮葉中各金屬元素含量與種源土壤中相關(guān)元素含量之間的關(guān)系，對所有茶鮮葉和對應(yīng)的種源土壤中各元素含量進行了Pearson相關(guān)分析，結(jié)果如表3所示。

表3 茶鮮葉與種源土壤間元素含量的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficient of element contents between fresh tea leaves and provenance soils

由表3可知，茶鮮葉與種源土壤中Na元素含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與Ca、Fe和 Cu的含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明茶鮮葉中金屬元素的含量隨著種源土壤中元素含量的增加而增加，影響順序為Fe＞Ca＞Cu＞Na。Zhao等[14]研究結(jié)果表明，茶鮮葉與種源土壤中Na、Ca和Fe的含量存在顯著性相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。元素Co含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而K含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。這表明隨著種源土壤中金屬元素含量的增加，茶鮮葉中的金屬元素的含量反而減少，且K含量的減少程度大于Co含量。其余元素（Mg、Zn和Mo）在茶葉和種源土壤之間不存在顯著線性相關(guān)，說明茶鮮葉中的金屬元素除了從種源土壤中獲取，可能還有其它來源，如降水或大氣沉降等。

2.3 不同品種茶鮮葉中金屬元素含量的變異分析

不同品種茶鮮葉中金屬元素含量見表4。

表4 不同品種茶鮮葉中金屬元素含量Table 4 The contents of metal elements in tea leaves of different varieties

2.4 不同季節(jié)茶鮮葉中金屬元素含量的變異分析

3個采樣地區(qū)不同季節(jié)茶鮮葉中金屬元素的平均含量如表5所示。

表5 不同季節(jié)茶葉中金屬元素含量Table 5 The contents of metal elements in tea leaves of different seasons

由表4可知，元素Mg、Co和Mo的含量在不同品種間存在極顯著差異（P＜0.01），而元素Fe和Cu的含量在不同品種間差異顯著（P＜0.05），不同品種間Na、K、Ca和Zn的含量差異不顯著。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)不同品種茶葉中的Mg和Cu的含量存在顯著性差異，與本研究結(jié)果相符。時鵬濤等[28]研究表明了礦物質(zhì)元素在不同品種茶葉中的含量存在一定差異；周娜等[29]研究發(fā)現(xiàn)不同品種茶葉中Cu和Zn的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與本研究對元素Cu含量的研究結(jié)果一致，而與Zn元素含量在不同品種間無顯著差異這一結(jié)果不相符，推測可能是因為所用茶樹品種不同，其代謝具有一定差異。

為探究茶鮮葉兩兩品種之間某一金屬元素含量的顯著性差異，進行了Duncan多重比較分析，結(jié)果表明，除元素Na、K、Ca和Zn含量在不同品種間無顯著差異外，其余元素（Mg、Co、Mo、Fe 和 Cu）在兩兩品種茶鮮葉間的元素含量比較中具有其各自顯著性差異。烏牛早茶鮮葉中金屬元素Mg的含量顯著高于安吉白茶和平陽特早茶，其Fe元素含量與平陽特早茶無明顯差異但顯著高于安吉白茶。平陽特早茶鮮葉中Co和Mo的含量顯著高于其余兩品種茶類，其Cu元素含量與烏牛早茶差異不顯著但顯著高于安吉白茶中Cu元素含量。

由表5可知，在不同季節(jié)中，茶鮮葉中Na、Mg、K、Ca和Zn含量存在極顯著差異（P＜0.01），Mo含量有顯著差異（P＜0.05），而 Fe、Co和 Cu含量無顯著性差異。趙穎等[30]報道了茶葉中Cu含量在不同收獲季節(jié)無顯著性差異，與本研究結(jié)果一致。

由Duncan多重比較分析可知，春季茶鮮葉中Zn元素含量在3個季節(jié)中最高且差異顯著；夏季茶鮮葉中元素K含量與春季茶無明顯差異但顯著高于秋季茶中K元素含量。與春夏兩季相比，秋季茶鮮葉中元素Na、Mg和Ca的含量顯著升高，而K和Zn含量顯著降低。由此推斷，不同季節(jié)茶鮮葉中金屬元素含量的差異可能受氣候條件的影響。

3個采樣地區(qū)2016年春、夏和秋3個季節(jié)的平均氣候條件見表6。

表6 采樣地區(qū)不同季節(jié)平均氣候情況Table 6 Weather conditions of different seasons in the sampling regions

由表6可知，不同季節(jié)的不同氣候條件如平均溫度、平均降水量以及光照時間等可能是造成不同季節(jié)茶鮮葉中金屬元素含量差異的主要原因。

2.5 產(chǎn)地、品種、季節(jié)等綜合作用對茶鮮葉中金屬元素含量的貢獻率解析

研究表明茶鮮葉中金屬元素含量在不同產(chǎn)地、品種和季節(jié)間均具有各自的含量特征，但各因素對茶鮮葉中各元素含量變異的貢獻率尚不清楚。因此，本研究進一步利用多因素方差分析分析產(chǎn)地、品種、季節(jié)及其交互作用對茶鮮葉中金屬元素含量變異的貢獻率。各影響因素及其交互作用對各元素顯現(xiàn)出不同的貢獻率，結(jié)果如表7所示。

表7 產(chǎn)地、品種、季節(jié)及其交互作用對茶鮮葉中各元素含量的貢獻率Table 7 Contribution rates of producing area，variety，season and their interactions to the contents of various elements in tea leaves

由表7可知，對元素Na含量貢獻率較高的是產(chǎn)地×品種以及產(chǎn)地×季節(jié)的交互作用，說明茶鮮葉中Na含量變異與產(chǎn)地×品種以及產(chǎn)地×季節(jié)的交互作用密切相關(guān)。季節(jié)對Mg、K、Ca和Zn含量的貢獻率最高，表明Mg、K、Ca和Zn的含量變異主要受季節(jié)的影響。產(chǎn)地對Fe和Cu含量貢獻率較高，說明產(chǎn)地對Fe和Cu含量變異有顯著影響；對Co含量貢獻率高的因素是產(chǎn)地及產(chǎn)地×品種的交互作用，表明Co含量變異與產(chǎn)地及產(chǎn)地×品種交互作用存在顯著相關(guān)；對Mo含量貢獻率影響較大的因素為季節(jié)×品種以及產(chǎn)地×品種×季節(jié)的交互作用，說明影響Mo含量變異的主要因素為季節(jié)×品種以及產(chǎn)地×品種×季節(jié)的交互作用。

3 結(jié)論

本研究表明，茶鮮葉中的金屬元素含量在不同產(chǎn)地、品種和季節(jié)均具有各自的特征，且產(chǎn)地、品種、季節(jié)均顯著影響茶鮮葉中金屬元素的含量。茶鮮葉中Na含量變異與產(chǎn)地×品種及產(chǎn)地×季節(jié)交互作用密切相關(guān)；Mg、K、Ca和Zn的含量變異與季節(jié)密切相關(guān)；Fe和Cu的含量變異與產(chǎn)地密切相關(guān)；Co含量變異與產(chǎn)地和產(chǎn)地×品種交互作用密切相關(guān)；Mo含量變異與季節(jié)×品種及產(chǎn)地×品種×季節(jié)的交互作用密切相關(guān)。本研究通過不同影響因素的角度對金屬元素含量間的差異進行了比較，創(chuàng)新地提出了產(chǎn)地、品種、季節(jié)及其交互作用對茶鮮葉金屬元素含量變異的綜合作用，可為茶葉真?zhèn)舞b別及選苗選地提供理論依據(jù)，為日常飲茶提供參考價值。