閻春英,付佐君,劉貴生,李 江,孫晨曦

閻春英,付佐君,劉貴生,孫晨曦,陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科 陜西省西安市 710000

李江,陜西省人民醫(yī)院腫瘤外科 陜西省西安市 710000

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第六大常見(jiàn)癌癥,被認(rèn)為是男性癌癥誘導(dǎo)死亡的第二大原因,女性第六大原因[1].在中國(guó),每年有78000余人死于肝細(xì)胞癌[2].目前,HCC患者的治療選擇有限,只有10%-20%的病例可以通過(guò)手術(shù)治愈,并且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高.對(duì)于肝癌患者來(lái)說(shuō),敏感、準(zhǔn)確和及時(shí)的診斷是解決這一令人頭疼的難題的關(guān)鍵[3].因此,HCC早期診斷成為HCC預(yù)后的最重要一步[4].開(kāi)發(fā)具有更好診斷性能的HCC血清標(biāo)志物成為肝細(xì)胞癌提高診斷準(zhǔn)確率的重要方式[5].近年來(lái),熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn),它在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用,是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞內(nèi)分子伴侶[6].由HSP90α、HSP90β、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein 94,Grp94)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1(tumor necrosis factor receptorrelated protein1,TRAP1)四個(gè)成員組成[7].此篇研究旨在比較甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)與HSP90在診斷肝癌方面的利弊,設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)評(píng)估血清HSP90對(duì)HCC的診斷準(zhǔn)確性,或聯(lián)合AFP提高HCC診斷價(jià)值.

1 材料和方法

1.1 材料 本研究選取2017-08/2020-07于陜西省人民醫(yī)院的住院患者及體檢中心健康者,共348例患者,其中肝細(xì)胞癌患者191位,肝硬化患者157位,健康對(duì)照者35位(健康體檢者HBV HCV均陰性).納入實(shí)驗(yàn)患者及健康對(duì)照組均已簽署知情同意書(shū),并通過(guò)倫理審批.納入標(biāo)準(zhǔn):肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì),肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn).肝硬化診斷符合《2019版中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì):肝硬化診治指南》[8],肝細(xì)胞癌診斷包括影像學(xué)及血清學(xué)及病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn),分期依照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[9].健康對(duì)組肝功正常,排除肝炎,肝硬化,并排除胃腸道腫瘤,膽胰,生殖系統(tǒng)及其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者.

1.2 方法空腹采集外周血2 mL,無(wú)溶血、脂血,2000 r/min離心8 min,分離血清,-20 ℃保存,采用微粒子酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清AFP,(AB-BOTT AXSYM全自動(dòng)免疫分析儀).采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清HSP90.AFP＞7 ng/mL,Hsp90＞90 ng/mL為陽(yáng)性表達(dá).靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/HCC患者總數(shù)×100%;特異性=真陰性例數(shù)/HCC患者總數(shù)×100%;準(zhǔn)確性=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/HCC患者總數(shù)×100%.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)處理及分析基于SPSS 22.0軟件,均數(shù)比較采用方差分析.建立接受者操作特性曲線,進(jìn)行計(jì)算血清AFP及血清HSP90診斷肝細(xì)胞癌敏感性及特異性,評(píng)估血清標(biāo)志物診斷價(jià)值.P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較 納入病例組及對(duì)照組共383例,其中病例組191例,對(duì)照組192例.應(yīng)用SPSS Statistics 21對(duì)實(shí)驗(yàn)各組樣本的一般臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,納入人群的基線特征及各血清標(biāo)志物比較(表1,表2),計(jì)算AFP和HSP90對(duì)于肝細(xì)胞癌診斷價(jià)值(表3).

表1 納入研究人群的基線特征及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 亞組分析 本研究納入383名受試者,分成以下亞組:(1)肝硬化早期組(Chlid-Pugh A級(jí)):納入患者44例;(2)肝硬化中期組(Chlid-Pugh B級(jí)):納入患者53例;(3)肝硬化晚期組(Chlid-Pugh C級(jí)):納入患者60例;(4)肝細(xì)胞癌早期組(BCLC 0-A期):納入患者140例;(5)肝細(xì)胞癌中期組(BCLC B期):納入患者51例;(6)對(duì)照組:35名健康志愿者.圖1顯示,HSP90和AFP在肝硬化組與肝細(xì)胞癌組中濃度變化趨勢(shì),肝硬化晚期組與肝細(xì)胞癌早期組及肝細(xì)胞癌中期組濃度變化顯著,相比于血清AFP,血清HSP90濃度隨著疾病的進(jìn)展過(guò)程中變化更加線性,更加符合早期診斷的要求.

圖1 疾病由肝硬化發(fā)展為肝細(xì)胞癌的變化過(guò)程中血清AFP及血清HSP90的濃度變化情況.A:HSP90在肝硬化組(A B C)、肝癌早中期(BCLC 0-A B)及健康體檢對(duì)照組中濃度水平變化;B:AFP在肝硬化組(A B C)、肝癌早中期(BCLC 0-A B)及健康體檢對(duì)照組中濃度水平變化.肝硬化組(A B C):肝硬化Chlid-Pugh分期;HCC(BCLC 0-A B):肝細(xì)胞癌巴薩羅那分期.HSP90:熱休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白;HCC:肝細(xì)胞癌.

2.3 以AFP、HSP90及性別作為聯(lián)合診斷指標(biāo)可提高肝細(xì)胞癌診斷準(zhǔn)確率 利用ROC曲線分析各組間中血清AFP、HSP90水平變化及年齡和性別變化(圖2).其中AFP的截?cái)嘀?約登指數(shù)最大值)為0.429,對(duì)應(yīng)靈敏度為61.5%,特異度為86.2%;HSP90的截?cái)嘀?約登指數(shù)最大值)為0.531,對(duì)應(yīng)靈敏度為82.5%,特異度為70.4%.

圖2 納入實(shí)驗(yàn)人群中HSP90、AFP及性別、年齡對(duì)于肝細(xì)胞癌診斷的ROC曲線圖.HSP90:熱休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白.

HCC診斷模型的構(gòu)建:以肝病狀態(tài)(HCC組,非HCC組)為應(yīng)變量,血清AFP、HSP90、性別、年齡、肝功水平測(cè)定結(jié)果為自變量,建立Logistic回歸模型.獲得HCC診斷概率預(yù)測(cè)模型HCC(P)=-4.555+0.884X性別(男=1,女=0)+0.157×AFP+0.25×HSP90;該模型經(jīng)過(guò)似然比檢驗(yàn),此回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),以預(yù)測(cè)變量PRE為檢驗(yàn)變量,診斷結(jié)果為狀態(tài)變量,做AFP,HSP90和性別三者聯(lián)合的ROC曲線分析(圖3).

圖3 新型診斷模型以性別、AFP、HSP90作為聯(lián)合診斷的ROC曲線圖.HSP90:熱休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白.

3 討論

肝細(xì)胞肝癌最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)是早期肝癌,但早期多無(wú)明顯的癥狀、體征,發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已為中晚期,總體5年生存率＜5%[10].AFP作為目前臨床上診斷肝細(xì)胞癌應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物其敏感性及特異性均不令人滿意.肝硬化結(jié)節(jié),脂肪浸潤(rùn),不典型肝臟炎性病灶及罕見(jiàn)的肝臟良性病變等均可發(fā)生AFP升高[11].目前,AFP作為應(yīng)用最廣泛的HCC血清標(biāo)志物,主要有兩個(gè)目的,一是評(píng)測(cè)HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),二是檢測(cè)發(fā)現(xiàn)亞臨床肝癌[12].對(duì)這種風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確評(píng)估,將HCC高?；颊吲c低危患者區(qū)分開(kāi)來(lái),可以有效地降低代償期肝硬化患者HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的成本效益[13].然而,HCC患者血清AFP水平與地區(qū)、種族、ALT及病毒感染等因素有關(guān),AFP不同診斷臨界值其敏感性和特異性差別很大,并且認(rèn)為對(duì)于肝硬化患者發(fā)生HCC,AFP的診斷及篩查價(jià)值很差[14].

近年來(lái),隨著腫瘤基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,肝細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物的研究越來(lái)越多,目前廣泛研究新型肝細(xì)胞癌標(biāo)志物包括甲胎蛋白異質(zhì)體(culinaris agglutinin A-reactive fraction of AFP,AFP-L3),高爾基體蛋白73(protein 73,GP73),脫-γ-羧基-凝血酶原(des-γcarboxy-prothrombin,DCP),骨橋蛋白(osteopontin,OPN)等.然而上述血清標(biāo)志物在研究中均發(fā)現(xiàn)存在敏感性不足的問(wèn)題,尚不能替代甲胎蛋白成為肝癌血清學(xué)診斷的指標(biāo).研究證明,與常用的腫瘤生物標(biāo)志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen21-1,CYFRA21-1)(肺癌)及AFP(肝癌)等相比,HSP90是一種更準(zhǔn)確的診斷生物標(biāo)志物[15].Sun等[16]使用差異蛋白質(zhì)組學(xué)及酶聯(lián)免疫吸附法分析證實(shí)HSP90對(duì)肝細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后有一定意義.Fu等[17]在一項(xiàng)大樣本、多中心臨床試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)HSP90診斷HCC的靈敏度可達(dá)92.7%,特異度為91.3%,提示HSP90在診斷AFP陰性的HCC中有較高價(jià)值.

肝癌的特點(diǎn)是男性發(fā)病率高于女性.肝癌的男女發(fā)病率在2:1到4:1之間變化.性別是肝癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素[18].本研究發(fā)現(xiàn)性別與HCC發(fā)生的相關(guān)性較年齡更為顯著.因此,在血清學(xué)評(píng)估患者肝細(xì)胞癌發(fā)生率時(shí),應(yīng)當(dāng)將性別納入評(píng)估范圍,這樣較單一使用AFP數(shù)值評(píng)估具有更高的可信度.先前研究證明肝硬化患者和肝癌患者的AFP明顯高于健康對(duì)照組.此外,HCC患者的AFP明顯高于非HCC患者[19].然而,本研究發(fā)現(xiàn),AFP的假陰性率較高,納入肝細(xì)胞癌早期組(BCLC 0-A期)140位患者中111位患者AFP陰性(cut-off值為7 ng/mL);肝細(xì)胞癌中期組(BCLC B期)51位患者中6位患者AFP陰性(cut-off值為7 ng/mL).同時(shí),HSP90作為新型肝細(xì)胞癌血清學(xué)標(biāo)志物,本研究中,其對(duì)于HCC的敏感度為82.5%,特異度為70.4%,準(zhǔn)確率為79.1%,相對(duì)于AFP有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),但特異度較AFP稍低.本文旨在通過(guò)建立診斷模型,聯(lián)合AFP、HSP90和性別指標(biāo),最大程度提高HCC診斷準(zhǔn)確率,運(yùn)用新的截?cái)嘀盗炕颊哳净糎CC風(fēng)險(xiǎn).

本研究通過(guò)回顧性收集來(lái)自陜西省人民醫(yī)院的肝硬化及肝細(xì)胞癌患者HSP90和AFP數(shù)值,通過(guò)分組比較肝硬化早、中、晚期及肝細(xì)胞癌早期和中期組中HSP90和AFP濃度差別,可得出HSP90和AFP對(duì)于肝細(xì)胞癌早期診斷都有一定的價(jià)值,從兩種標(biāo)志物聯(lián)合提高診斷價(jià)值為切入點(diǎn),應(yīng)用逐步回歸方法篩選診斷效能較高的聯(lián)合檢測(cè)模型,納入該預(yù)測(cè)模型的指標(biāo)是AFP、HSP90、性別、年齡,被剔除的模型是年齡、ALT、AST.將新型HCC診斷模型命名為SAH(Sex,AFP and HSP90).

如圖3,圖4,SAH作為HCC單獨(dú)診斷的ROC曲線,其AUC為0.901,截?cái)嘀?約登指數(shù)最大值)為0.614,對(duì)應(yīng)靈敏度為87.8%,特異度為76.8%;相較于AFP或HSP90,SAH聯(lián)合診斷不僅提高了診斷靈敏度,同時(shí)也有較高的特異度,亞組分析中隨著SAH數(shù)值變化較AFP或HSP90單一數(shù)值變化更有階段性并更顯著.因此對(duì)于肝細(xì)胞癌的早期診斷具有臨床意義.

圖4 SAH(Sex,AFP,HSP90)聯(lián)合診斷在肝硬化組(A B C)、肝癌早中期(HCC BCLC 0-A B)及健康體檢對(duì)照組中濃度水平變化.肝硬化組(A B C):肝硬化Chlid-Pugh分期;HCC(BCLC 0-A B):肝細(xì)胞癌巴薩羅那分期.HSP90:熱休克蛋白90;AFP:甲胎蛋白;HCC:肝細(xì)胞癌.

隨著HCC的早期診斷技術(shù)的發(fā)展,AFP呈陰性或低濃度的病例不斷增多,為了提高HCC的診斷價(jià)值,聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物診斷成為提高HCC診斷價(jià)值成為目前可行的方法[20].本研究證明AFP對(duì)于肝細(xì)胞癌早期診斷的準(zhǔn)確率較低,假陰性率較高,通過(guò)回歸分析建立診斷HCC模型證明HSP90可提高AFP陰性的肝細(xì)胞癌早期診斷價(jià)值,對(duì)于HCC的早期診斷具有重要意義.

4 結(jié)論

本研究表明,與肝硬化及健康對(duì)照組患者相比,肝細(xì)胞癌患者的HSP90水平顯著升高.與AFP相比,HSP90對(duì)于肝細(xì)胞癌的診斷靈敏度更高.應(yīng)用回歸獲得的預(yù)測(cè)模型診斷HCC時(shí),敏感性顯著提高.故此,AFP,HSP90聯(lián)合檢測(cè)效果優(yōu)于AFP單獨(dú)檢測(cè),能夠提高肝癌早期診斷率.

本次研究存在一些局限性,例如數(shù)據(jù)來(lái)源于單中心,樣本量較小,沒(méi)有考慮地域及人種差異.因此,需要更深入、更嚴(yán)格的設(shè)計(jì)、大樣本量、不同病因和多個(gè)協(xié)作中心的研究.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)對(duì)于肝細(xì)胞癌診斷的準(zhǔn)確率逐年降低,新型肝細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物研究深入,新老血清標(biāo)志物的聯(lián)合診斷成為提高診斷價(jià)值的重要方法.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)與AFP聯(lián)合診斷提高肝細(xì)胞癌診斷率.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

通過(guò)構(gòu)建診斷模型,得出聯(lián)合診斷可提高診斷敏感性和特異性.

實(shí)驗(yàn)方法

利用SPSS構(gòu)建肝細(xì)胞癌新型診斷模型,得出診斷公式以證明聯(lián)合診斷可提高診斷價(jià)值.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

AFP聯(lián)合HSP90的肝細(xì)胞癌診斷靈敏度和特異度較二者單一診斷有了顯著提升.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

新型診斷模型利用聯(lián)合診斷公式有效提高了肝細(xì)胞癌診斷敏感性和特異性,對(duì)提高肝細(xì)胞癌診斷價(jià)值有更重要意義.

展望前景

本研究構(gòu)建的新型肝細(xì)胞癌診斷模型可較少增加診斷成本的同時(shí),極大提高診斷準(zhǔn)確率,未來(lái)可通過(guò)多中心研究歸納統(tǒng)計(jì)結(jié)果,對(duì)結(jié)果的危險(xiǎn)程度分級(jí),對(duì)肝細(xì)胞癌的極早期診斷做出貢獻(xiàn).