祝文君,胡湛斐,袁 周

祝文君,胡湛斐,卡替(上海)細(xì)胞生物技術(shù)有限公司 上海市 200433

袁周,上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院 上海市 200233

0 引言

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一.據(jù)中國國家癌癥中心統(tǒng)計[1],預(yù)估全國2015年胰腺癌發(fā)病率為6.92人/10萬人,位居人類實體腫瘤第十位;死亡率6.16人/10萬人,位居人類實體腫瘤第六位.而根據(jù)美國癌癥研究協(xié)會的調(diào)查,2020年美國胰腺癌死亡率高居腫瘤相關(guān)死亡的第四位,胰腺癌的防控形勢非常嚴(yán)峻.

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是胰腺癌的最常見組織學(xué)類型,是最具侵襲性的消化道惡性腫瘤,預(yù)后極差,中位生存期僅6個月,5年生存率9%[2].手術(shù)是唯一可能根治胰腺癌的方法.但由于缺乏有效的早期診斷方法及腫瘤的高侵襲性,80%-85%的PDAC患者在發(fā)現(xiàn)時已處于晚期,僅有約20%的患者在確診后適宜接受根治性切除術(shù)治療,這部分患者5年生存率也只有20%[3].盡管近年來有關(guān)胰腺癌的治療取得一定的進(jìn)步,但其預(yù)后沒有得到明顯改善.

正常情況下,免疫系統(tǒng)可以識別并清除腫瘤細(xì)胞,但為了生存和生長,腫瘤細(xì)胞能夠采用不同策略,使人體的免疫系統(tǒng)受到抑制,不能正常的殺傷腫瘤細(xì)胞,從而在抗腫瘤免疫應(yīng)答的各階段得以幸存.近年來,人們利用各種手段重新激活或者增強機體的腫瘤免疫,如免疫檢查點抑制劑(checkpoint inhibitors,ICIs)和細(xì)胞治療等,獲得了較好的療效,顯著改善了癌癥患者的生存狀況.

免疫治療在部分腫瘤治療中有一定突破,但單一使用一種免疫治療,并不能顯著改善胰腺癌患者的生存情況.本文將結(jié)合胰腺癌微環(huán)境的特點以及免疫治療進(jìn)展,對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)在胰腺癌中研究進(jìn)展進(jìn)行概述,為胰腺癌的治療提供新的思路.

1 胰腺癌腫瘤微環(huán)境與預(yù)后

一些致癌因素導(dǎo)致基因突變或者部分蛋白異常表達(dá),會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變.在腫瘤的發(fā)展過程中,癌細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識別后,第一階段,也就是細(xì)胞癌變早期,癌細(xì)胞被免疫細(xì)胞識別清除;下一階段,當(dāng)致癌因素持續(xù)存在刺激的情況下,癌變細(xì)胞類型和數(shù)量增多,癌癥和免疫力達(dá)到動態(tài)平衡;最后階段,腫瘤細(xì)胞釋放一些免疫抑制因子,誘導(dǎo)機體免疫失活,形成免疫逃逸,腫瘤得以在體內(nèi)生長,腫瘤的微環(huán)境就此產(chǎn)生.機體與腫瘤雙方博弈的主要陣地就是腫瘤微環(huán)境[4].

胰腺癌腫瘤微環(huán)境的特征是廣泛致密的增生間質(zhì),包括細(xì)胞外基質(zhì)成分和異種細(xì)胞群,其中含有多種類型的免疫細(xì)胞,但這些免疫細(xì)胞多處于數(shù)量與功能的失衡狀態(tài),通常表現(xiàn)為具有抗腫瘤作用的CD4+、CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞數(shù)量減少,并呈現(xiàn)無功能的或不成熟的表型和狀態(tài),而具有免疫抑制作用的Tregs、髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC)及腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)功能活躍且大量存在[5-9].研究表明[10-12],腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞以及MDSC對腫瘤的浸潤、增殖、轉(zhuǎn)移等都具有促進(jìn)作用.此外,微環(huán)境中的免疫抑制分子粘著斑激酶(FAK)、透明質(zhì)酸和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)等[13-15]也對機體的免疫起負(fù)調(diào)控作用.腫瘤微環(huán)境中的Treg細(xì)胞通過分泌抑制性細(xì)胞因子介導(dǎo)了效應(yīng)T細(xì)胞對胰腺癌腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生免疫耐受,嚴(yán)重影響CD8+CTL的功能,從而使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[13-17].冷腫瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)中的腫瘤微環(huán)境(TME)含有較多抑制性免疫細(xì)胞以及豐富的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),細(xì)胞毒性T細(xì)胞很少浸潤[18].相反,“熱腫瘤”(如黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌)TME中有較多T細(xì)胞浸潤,對ICIs較為敏感[19].PDAC被認(rèn)為是冷腫瘤,對包括免疫檢查點抑制劑在內(nèi)的免疫療法不敏感[20,21].

腫瘤微環(huán)境不僅與胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制有關(guān),而且可能與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān).有研究表明[22],腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的數(shù)量與胰腺癌腫瘤進(jìn)展及不良的預(yù)后效果成正相關(guān).另外,腫瘤微環(huán)境中的肥大細(xì)胞通過促進(jìn)血管生成、癌細(xì)胞增殖和侵襲影響腫瘤生長[23].結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中,腫瘤組織肥大細(xì)胞浸潤預(yù)測長期預(yù)后較差[24-26].

TIL是存在于腫瘤實質(zhì)與間質(zhì)內(nèi)的免疫細(xì)胞,是機體免疫系統(tǒng)對腫瘤局部免疫應(yīng)答的直接反應(yīng),也是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,在腫瘤免疫機制中起免疫應(yīng)答和調(diào)控作用,其主要包括CD3+T淋巴細(xì)胞(75%的TILs)、CD20+B淋巴細(xì)胞(＜20%的TILs)、單核細(xì)胞(＜l0%的TILs)和NK細(xì)胞(＜5%的TILs)等.TIL中的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫是有效且持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵性基礎(chǔ).TIL可用于對PDAC的預(yù)后評價[27-30],研究表明在PDAC患者中TIL的高水平浸潤與更好的預(yù)后相關(guān),TIL可能通過分泌TNF-α抑制PDAC的生長[31].腫瘤組織T細(xì)胞中IL-22的高表達(dá),與腫瘤分期和不良預(yù)后顯著相關(guān)[32].有研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織TIL分泌的膜結(jié)合或分泌蛋白semaphorin-4D參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)[33].

理論上,PDAC細(xì)胞周圍的T細(xì)胞密度越高,T細(xì)胞發(fā)揮的功能越強.PDAC微環(huán)境中CTL的高度浸潤才能有效攻擊腫瘤細(xì)胞.腫瘤微環(huán)境中其它免疫細(xì)胞如肥大細(xì)胞、Treg等對胰腺癌患者預(yù)后評價都有一定的意義.腫瘤微環(huán)境中免疫狀態(tài)可幫助評估PDAC患者術(shù)后的預(yù)后情況.同時,有針對性的選擇治療方法,才能更有效地攻克胰腺癌治療難題.

2 TIL療法與應(yīng)用于胰腺癌治療的可能性

TIL是存在于腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結(jié)、癌性胸腹水中的一群高度異質(zhì)性細(xì)胞,相比于外周血淋巴細(xì)胞,TIL細(xì)胞中含有較高比例的活化的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞,這一類淋巴細(xì)胞經(jīng)過體外分離、擴增、活化后,對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性提高.

TIL細(xì)胞治療癌癥的機理是這些T細(xì)胞實際上已經(jīng)浸潤在組織內(nèi)部,可以識別腫瘤多抗原靶點,并識別并殺死癌細(xì)胞.與嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)和T細(xì)胞受體嵌合型T細(xì)胞免疫療法(chimeric T cell receptor T-cell immunotherapy,TCR-T)相比,TIL療法存在著一系列優(yōu)勢:(1)TIL療法由靶向癌細(xì)胞中多種抗原的T細(xì)胞組成,因此可以通過多個靶點激發(fā)對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng),而CAR-T和TCR-T細(xì)胞療法通常只能靶向一個抗原,這讓癌細(xì)胞可能更容易對它們產(chǎn)生抗性,這跟腫瘤的異質(zhì)性有關(guān),TIL可以殺死更多群體的腫瘤細(xì)胞;(2)CAR-T療法在治療實體瘤方面進(jìn)展有限,而TIL療法已經(jīng)在多種癌癥類型中產(chǎn)生了可喜的療效[34];(3)TIL療法使用的細(xì)胞是遷移到腫瘤中的天然TIL細(xì)胞,一般不進(jìn)行基因改造,目前還未觀察到在其它細(xì)胞治療中常見的脫靶效應(yīng)和細(xì)胞因子釋放綜合征等毒副作用,如表1所示.

表1 TIL療法優(yōu)勢對比

TIL療法的應(yīng)用史可以追溯至上世紀(jì)80年代,1986年由Rosenberg等[35]首次嘗試用TIL細(xì)胞治療癌癥.1988年研究表明[36],從黑色素瘤患者的腫瘤組織中分離的TIL,經(jīng)過離體培養(yǎng)擴增后回輸至患者體內(nèi),有效緩解了患者的病情惡化.Rosenberg在2002年報道化療聯(lián)合TIL治療13例黑色素瘤患者,其中10例表現(xiàn)出不同程度的緩解[37];從1994年到2008年間,Rosenberg研究組結(jié)合放化療和過繼性T細(xì)胞療法,將黑色素瘤的客觀緩解率(objective response rate,ORR)從34%提高到72%[38].2013年報道CD4+/CD8+混合TIL群體自體輸注療效優(yōu)于CD8+富集TIL群體[39].隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展,Rosenberg將外顯子深度測序技術(shù)與TIL技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)出更為個體化的TIL精準(zhǔn)醫(yī)療手段[40-43].2014年報道一名攜帶ERBB2IP突變的黑色素瘤患者經(jīng)特異性CD4+TH1 TIL輸注后,病情緩解,實現(xiàn)一年半的帶瘤生存,經(jīng)第二次95%CD4+TH1 TIL輸注,病情再度緩解,并且在其后6個月隨訪期內(nèi)腫瘤持續(xù)性縮小[44].2019年ASCO公布的INNOVA TIL-04宮頸癌臨床II期研究數(shù)據(jù)[45],27名復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或持續(xù)性宮頸癌患者,平均年齡45歲,之前平均接受2.4種治療方案,平均注射TIL細(xì)胞量:2.8×1010個,中位隨訪時間7.4個月,沒有發(fā)現(xiàn)任何嚴(yán)重副作用,而且客觀緩解率達(dá)到44%,TIL療法已獲FDA“突破性療法”認(rèn)定(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03108495),表明TIL療法應(yīng)用于實體瘤以正在成為可能.

近年來TIL治療的出色表現(xiàn)得益于技術(shù)的進(jìn)步:(1)輸注前清淋處理,殺死抑制性免疫細(xì)胞并給輸注的TIL提供空間;(2)輸注幼稚細(xì)胞(Young TIL),新工藝快速擴增技術(shù)(rapid expand protocol,REP)能在14天內(nèi)將從腫瘤組織分離的TIL迅速擴增數(shù)千倍,細(xì)胞產(chǎn)品中含更多的TCM,其對腫瘤的殺傷作用優(yōu)于長時間培養(yǎng)制備的細(xì)胞產(chǎn)品,后者含有更多的療效差一些的TEM;(3)TIL輸注后同時大劑量用IL-2維持TIL體內(nèi)增殖.

近年來,單一使用樹突狀細(xì)胞疫苗、溶瘤病毒和免疫抑制劑等免疫治療PDAC一直沒有突破性進(jìn)展.導(dǎo)致胰腺癌失敗的原因有很多,免疫抑制性腫瘤微環(huán)境(TME)是關(guān)鍵因素,其特征是效應(yīng)T細(xì)胞浸潤差[46-48],以及較低的腫瘤突變負(fù)荷[49,50].近期研究顯示[51-53],部分腫瘤患者表現(xiàn)出效應(yīng)T細(xì)胞高水平浸潤,這部分患者擁有更長的總生存期,提示個體化治療胰腺癌可能改善患者的生存狀況.通過將TME從“冷”變?yōu)椤盁帷眮硗黄芇DAC中的免疫屏障,可能與其他療法聯(lián)用增強療效.研究表明溶瘤病毒療法可使TME由冷變熱[54],增加T細(xì)胞的浸潤,增強ICIs對晚期黑色素瘤患者的抗腫瘤作用[55].此外,溶瘤病毒療法誘導(dǎo)產(chǎn)生包括腫瘤抗原在內(nèi)的腫瘤裂解物可以觸發(fā)機體的先天性和獲得性免疫反應(yīng)[56].這種使胰腺癌由冷變熱方法的出現(xiàn),為廣泛利用TIL療法治療胰腺癌提供了契機.

機體具有抗癌活性的T淋巴細(xì)胞是使用過繼細(xì)胞治療的先決條件.TIL在胰腺癌治療方面的研究還比較少.2016年Meng[57]報道了從PDAC患者提取TIL的方法.作者通過添加培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子(IL-2、IL-15、IL-21)來擴增TIL,培養(yǎng)10天后,補充CD3抗體(OKT3)和輻照過的PBMC,17例胰腺癌來源的腫瘤組織塊,均可獲得含大量CD8+T細(xì)胞的TIL,并通過篩選可以得到高表達(dá)IFNγ的TIL.這些都說明了TIL療法在胰腺癌治療中具有巨大潛力.

3 TIL療法在胰腺癌中的難點與發(fā)展趨勢

TIL療法由于其在治療實體瘤的優(yōu)勢,特別是在黑色素瘤、宮頸癌等腫瘤方面的突出效果,應(yīng)用其治療胰腺癌是一個很好發(fā)展方向.TIL細(xì)胞因其浸潤在腫瘤組織內(nèi)部,在空間上與各種異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞接觸,隨著基因重排,表達(dá)豐富的TCR可以識別來自腫瘤細(xì)胞表面和內(nèi)部的抗原,應(yīng)對多個腫瘤細(xì)胞群體,這可能是人們利用TIL治療實體瘤獲得突破的原因之一,但在胰腺癌的治療中也存在一定的難點,如表2所示.通過對TIL細(xì)胞表面TCR進(jìn)行測序可以分析,并進(jìn)行親和力檢測,基因改造后篩選出親和力更強的TCR,通過轉(zhuǎn)基因的方法裝配到T細(xì)胞的表面可以更精準(zhǔn)的靶向并識別胰腺癌,或者直接篩選相應(yīng)的TIL細(xì)胞群體,也可能是TIL療法應(yīng)用的方向.Lu等人[58]從TIL獲得的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞獲得其T淋巴細(xì)胞受體(TCR)的遺傳信息,通過基因治療將患者外周血中的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,也有可能改善腫瘤的治療精準(zhǔn)度和細(xì)胞制備時間. 另外,使用胰腺癌腫瘤新生抗原(neoantigen)刺激TIL可以獲得精準(zhǔn)靶向更多細(xì)胞群體T細(xì)胞,增強TIL對腫瘤殺傷的精準(zhǔn)性.Tran等[44]通過這種方法已經(jīng)臨床治愈了一位肝肺轉(zhuǎn)移的膽管癌患者.不過,當(dāng)前基因測序所使用的腫瘤樣本,通常只是腫塊中的一小部分,無法代表整個腫瘤的基因突變狀況,這為腫瘤新抗原的選擇增加了新的變量.同時腫瘤新生抗原預(yù)測準(zhǔn)確性較低,難以實現(xiàn)較高的產(chǎn)品性價比.還有就是開發(fā)和生產(chǎn)周期過長,目前腫瘤新抗原藥物開發(fā)、生產(chǎn)的時間在18周左右,腫瘤患者愿不愿意等待以及能不能夠等待這么長時間將是腫瘤新抗原藥物應(yīng)用的一大障礙.除此之外,通過篩選,對大量同種癌癥患者腫瘤組織進(jìn)行高通量測序,分析腫瘤相關(guān)抗原和新生抗原,形成腫瘤抗原庫,最后用抗原庫的抗原刺激體外培養(yǎng)的TIL治療胰腺癌,可能沒有前一種精準(zhǔn),但也很有可能會進(jìn)一步提高效果,這種方法僅僅是開始,還沒有臨床數(shù)據(jù).因而,目前臨床上主要是采用已經(jīng)比較成熟的針對多克隆TCR、未篩選(unselected)、幼稚細(xì)胞(young TIL)產(chǎn)品.隨著測序技術(shù)以及新抗原預(yù)測模型的進(jìn)步,將來也許可以改善當(dāng)前的困境.

表2 TIL療法治療胰腺癌難點以及可能解決方案

雖然TIL出現(xiàn)在腫瘤的微環(huán)境中,卻不意味著癌細(xì)胞就可以被消滅,具有免疫抑制作用的腫瘤微環(huán)境限制了它們的數(shù)量和活性,削弱了有效攻擊癌細(xì)胞的能力,此外,TEM中還存在旁觀T細(xì)胞.假定擴增的TIL都具有殺傷活力,回輸后在外周血能證明起活性,但TME會誘導(dǎo)其失活導(dǎo)致效果降低,聯(lián)合PD-1或者anti-PD1-TIL可能是更具有前景的一種策略.

體內(nèi)數(shù)百種類型的T細(xì)胞,并不是每個都能成為好的癌癥戰(zhàn)士.目前的方法從胰腺癌腫瘤細(xì)胞中分離培養(yǎng)的TIL可能是耗竭的T細(xì)胞[59],如果培養(yǎng)這些細(xì)胞后回輸效果可能不理想,所以也需要篩選并恢復(fù)T細(xì)胞的活性.TILs是高度異質(zhì)性的細(xì)胞群,不同患者和不同腫瘤之間均有較大差異.研究表明[60],表達(dá)CD39+的TIL細(xì)胞具有抗癌能力,但其免疫活性受到腫瘤抑制,CD39-的TIL更多意義上是個旁觀者.CD39有可能成為鑒別腫瘤特異性TIL、評估患者對基于TIL的免疫療法敏感性的有效標(biāo)志物,或者作為篩選TIL的標(biāo)志物,成為多種免疫治療方法的有效輔助手段.

當(dāng)前限制TILs廣泛應(yīng)用的另一個主要問題是如何高效提取培養(yǎng)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的TILs細(xì)胞并使其擴增到臨床治療的數(shù)量級.過去TIL的擴增大多需要較長的時間,一些病程進(jìn)展較快的患者根本無法使用TIL進(jìn)行治療.較少的特異性TIL還不足以消除腫瘤.因此,需要擴大特異性TIL的數(shù)量,以提高TIL治療的療效.Jin等人[61]提出了利用G-REX培養(yǎng)瓶對TIL進(jìn)行原代培養(yǎng)和快速擴增的方法,大大促進(jìn)了TIL的生產(chǎn),用IL-2與4-1BB抗體和CD3抗體聯(lián)合培養(yǎng)TIL可顯著提高培養(yǎng)效率,這種方法目前用于高分化漿液性卵巢癌.Poch等[62]通過添加4-1BB抗體,優(yōu)化原發(fā)性膀胱腫瘤中TIL的擴增,為膀胱癌的治療奠定了基礎(chǔ).另外,Tavera等人[63]提出了一種基于CD137/4-1BB和白細(xì)胞介素-2刺激的TIL擴增新方法,可以優(yōu)先大量擴增CD8-TIL,在這種方法中,TIL的擴增率迅速增加,黑色素瘤中TIL的擴增時間不到三周.

TIL必須到達(dá)腫瘤部位才能發(fā)揮作用,如何使T細(xì)胞歸巢腫瘤,也是提高TIL治療胰腺癌的重大命題.在過繼性細(xì)胞治療中,回輸?shù)腡細(xì)胞中僅有1%-2%真正浸潤到腫瘤組織中.活化的T細(xì)胞不能有效靶向穿透到腫瘤實質(zhì),成為限制過繼性細(xì)胞治療發(fā)揮有效抗腫瘤作用的關(guān)鍵因素.抗血管生成靶向藥可以通過改善腫瘤血供而將胰腺癌TEM抑制狀態(tài)恢復(fù)至正常狀態(tài),并可能增加T細(xì)胞歸巢數(shù)量,因此,TIL聯(lián)合抗血管生成靶向藥可能會是一個比較好的方向.放療和清淋預(yù)處理可以創(chuàng)造有利于T細(xì)胞歸巢的腫瘤局部微環(huán)境[34].趨化因子的不匹配、血管異常、內(nèi)皮細(xì)胞無能、腫瘤局部抑制微環(huán)境等是阻礙T細(xì)胞高效歸巢的主要因素.為了進(jìn)一步提高TIL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,科學(xué)家們做了相關(guān)研究.目前,在黑色素瘤中有許多方法可以提高TIL到達(dá)腫瘤部位的效率,相關(guān)實驗證明,TIL中內(nèi)源性CXCR1-TIL細(xì)胞遷移至黑色素瘤的數(shù)量較多,這種方法有望擴展到其他腫瘤[64].

4 展望

隨著免疫治療技術(shù)的發(fā)展,特別是免疫檢查點抑制劑以及DC疫苗,溶瘤病毒等在胰腺癌治療方面的研究,胰腺癌的治療也有了一定進(jìn)步,但是復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率居高不下,難以顯著改善患者的存活率.

治療的主要難點是改善胰腺癌的腫瘤微環(huán)境,增強腫瘤殺傷的能力.TIL因其特點有望改善胰腺癌治療現(xiàn)狀.應(yīng)用TIL治療胰腺癌,則需要篩選有效的TIL細(xì)胞,改善TIL培養(yǎng)工藝,提高TIL歸巢到腫瘤組織的能力.TIL中有大量的旁觀者細(xì)胞[65],雖然浸潤在腫瘤組織內(nèi)部,但是不發(fā)揮抗腫瘤活性.因此,改善TIL細(xì)胞的活性與精準(zhǔn)度也是治療胰腺癌必要的過程.改變胰腺癌腫瘤微環(huán)境的免疫抑制特性,轉(zhuǎn)化冷腫瘤為熱腫瘤(免疫檢查點PARP抑制劑以及溶瘤病毒改善腫瘤微環(huán)境),使之對免疫治療更加敏感,然后聯(lián)合TIL療法進(jìn)行治療,有可能達(dá)到治愈胰腺癌的目的.