嚴大為，郭丹丹，莫俊超，舒耀皋*，鄭賽晶*

1.上海新型煙草制品研究院，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733號201315

2.上海化工院檢測有限公司，上海市普陀區(qū)云嶺東路345號200062

3.上?；瘜W(xué)品公共安全工程技術(shù)研究中心，上海市普陀區(qū)云嶺東路345號200062

近年來，加熱卷煙的出現(xiàn)給煙草消費者提供了一種新的獲取煙堿的途徑。加熱卷煙主要通過加熱再造煙葉煙絲的方式釋放含有煙堿的氣溶膠［1-2］。與傳統(tǒng)卷煙相比，加熱卷煙氣溶膠中含有的有害成分較少［3］。使用過后的加熱卷煙煙支廢棄物含有過濾嘴、卷煙紙和加熱過的再造煙葉煙絲，這與傳統(tǒng)卷煙煙蒂具有一定的相似性。當(dāng)前對加熱卷煙的風(fēng)險評估研究多集中于加熱卷煙氣溶膠的健康風(fēng)險評估和室內(nèi)空氣中煙氣關(guān)注成分的殘留研究，對加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的研究報道相對較少［4-5］。因此，研究了加熱卷煙煙支廢棄物浸出液在生態(tài)環(huán)境中的水生生物急性毒性、陸生生物急性毒性、固有生物降解性和生物蓄積性，旨在為加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的環(huán)境風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

熱卷煙煙支廢棄物（某品牌境外市售加熱卷煙，實測氣溶膠中釋放量：煙堿0.7 mg/支、焦油28 mg/支），采用加拿大深度抽吸方法（抽吸參數(shù)：抽吸體積55 mL、抽吸間隔30 s、抽吸持續(xù)時間2 s），用吸煙機抽吸后獲得加熱卷煙煙支廢棄物。按照化學(xué)品測試指導(dǎo)原則中生物系統(tǒng)效應(yīng)部分的要求配制實驗中需要的ISO稀釋水、Elendt M4培養(yǎng)基、活性污泥培養(yǎng)基和實驗用人工土壤等［6］。

甲醇（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

Multitron Pro全功能振蕩培養(yǎng)箱（瑞士Infors HT公司）；CL8R型超大容量冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、CX21型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；Multi 3420型便攜式水質(zhì)分析儀（德國Xylem公司）；ME204E型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KBF-LQC 720人工氣候箱（德國Binder公司）；HI99121型便攜式土壤酸度計（意大利Hanna公司）；DGG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器）；PF-8000型呼吸儀系統(tǒng)（美國RSA公司）；multi N/C 2100型TOC/TN儀（德國Analytik Jena公司）；1290/AB QTRAP4500型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent/AB公司）；KQ-500DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H2050R型離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；0.22 μm水相、0.22 μm有機相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 受試生物

使用OECD實驗導(dǎo)則推薦的受試生物：羊角月 牙 藻（Pseudokirchneriella subcapitata）、大 型 溞（Daphnia magna Straus）、斑 馬 魚（Brachydanio rerio）、赤子愛勝屬蚯蚓（Eisenia foetida）和活性接種物（接種物均采自上海市，具體地點為寶山區(qū)湄浦河、吳淞碼頭、吳淞污水處理廠、泗塘生活污水處理廠、嘉定區(qū)顧浦河、嘉定區(qū)吳淞江、青浦區(qū)朝陽河、松江區(qū)新中河、閔行區(qū)俞塘河、普陀區(qū)長風(fēng)公園中心湖的新鮮地表水、表土和活性污泥的混合物，實驗開始前共馴化65 d，平均濃度為3 640 mg懸浮固體/L）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制方法

溶液配制方法參考OECD化學(xué)品測試準則［7］和文獻［6］中的化學(xué)品測試方法，并根據(jù)加熱卷煙煙支廢棄物的特點進行了適當(dāng)改進。具體為：取32支加熱卷煙煙支廢棄物加入到2 L的OECD培養(yǎng)基（或稀釋水）中，在200 r/min轉(zhuǎn)速下機械攪拌24 h；靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液過水相濾膜，得到濃度為16支/L的實驗溶液。后續(xù)依次用培養(yǎng)基（或稀釋水）按1∶1的比例稀釋，得到所需濃度的實驗溶液。

1.3.2 羊角月牙藻生長抑制實驗

在正式實驗前先開展了預(yù)實驗以獲取實驗濃度范圍，根據(jù)羊角月牙藻預(yù)實驗結(jié)果，正式實驗濃度 設(shè) 置 為0.125、0.250、0.500、1.00、2.00、4.00和8.00支/L等7個濃度梯度。同時采用OECD培養(yǎng)基作為空白對照組，空白對照組設(shè)置6個平行，各濃度組分別設(shè)置3個平行。每個平行的實驗溶液體積為100 mL，搖勻后放入全功能振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為23℃，連續(xù)光照強度為5 860~6 190 Lux，光質(zhì)為白光，振蕩方式為連續(xù)振蕩（100±10）次/min，實驗溶液的初始羊角月牙藻細胞濃度為1×104個/mL。實驗觀察期為72 h，采用顯微鏡細胞計數(shù)法測定羊角月牙藻的細胞濃度。每隔24 h測定羊角月牙藻的細胞濃度，每隔72 h觀察藻細胞的生長情況［6-7］。

1.3.3 大型溞急性活動抑制實驗

在正式實驗前先開展了預(yù)實驗以獲取實驗濃度范圍，根據(jù)大型溞預(yù)實驗結(jié)果設(shè)定正式實驗濃度，正式實驗濃度為0.125、0.250、0.500、1.00、2.00和4.00支/L。實驗溶液配制方法同1.3.1節(jié)。先配制母液，后用ISO稀釋水將母液等梯度逐級稀釋得到各濃度的驗溶液。同時進行空白對照組實驗，對照組和處理組各設(shè)4個平行。每個平行的實驗溶液體積為20 mL，置于100 mL玻璃燒杯中用于測試。每個平行放5只大型溞，每組共用20只大型溞。實驗在溫度為18~22℃、光照強度1 127~1 279 Lux的Binder人工氣候箱中進行，每天光照16 h。實驗開始時和結(jié)束后，測定空白對照組和濃度組的pH、溶解氧和溫度，并在24和48 h時記錄大型溞受抑制的數(shù)量及中毒癥狀。

1.3.4 斑馬魚急性毒性實驗

在正式實驗前先開展了預(yù)實驗以獲取實驗濃度范圍，根據(jù)斑馬魚預(yù)實驗結(jié)果，正式實驗共設(shè)4個濃度組進行實驗，分別為0.500、1.00、5.00和15.0支/L，同時進行空白對照實驗，實驗不設(shè)平行，每個處理組7尾斑馬魚。采用流水式的動態(tài)暴露方式進行染毒暴露，每組實驗溶液的體積為2 L，實驗周期為96 h。在實驗開始后3、6、24、48、72及96 h觀察記錄實驗魚的死亡及中毒癥狀情況，并記錄任何明顯的異?，F(xiàn)象（如平衡能力、游泳行為、呼吸功能、色素沉積等方面異常）。

1.3.5 蚯蚓急性毒性實驗

在正式實驗前先開展了預(yù)實驗以獲取實驗濃度范圍，根據(jù)蚯蚓急性毒性預(yù)實驗結(jié)果，正式實驗采用限度實驗，限制濃度為每千克（干質(zhì)量）人工土壤中60支加熱卷煙煙支廢棄物，同時設(shè)置空白對照組。每個處理組設(shè)4個平行，每個平行10條蚯蚓。空白對照組不添加加熱卷煙煙支廢棄物浸出液，其他處理相同。母液配制過程與同1.3.1節(jié)，配制完成后，取150 mL母液與500 g人工土壤混合，并機械攪拌后再手拌混勻。充分攪拌均勻后，測定土壤的含水量和pH。將處理土壤分別轉(zhuǎn)入實驗容器中，清洗干凈的蚯蚓單獨稱量，放在土壤表面，蚯蚓在短時間內(nèi)鉆入人工土壤。用扎好小孔（不少于8個）的保鮮膜覆蓋在容器上以防實驗介質(zhì)變干；放入溫度為（20±2）℃，相對濕度為（80±15）%的人工氣候箱內(nèi)，位置隨機。實驗第7天，將實驗容器內(nèi)的實驗土壤輕輕倒入托盤中，取出蚯蚓，查看其存亡情況（檢驗不動蚯蚓尾部對針刺的反應(yīng)），觀察記錄各實驗容器中蚯蚓顯著的體征病理變化或顯著行為變化。檢查結(jié)束后，將實驗介質(zhì)和蚯蚓重新置于實驗容器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。第14天時再查看蚯蚓的死亡情況和毒性癥狀。實驗結(jié)束時測定存活蚯蚓的體質(zhì)量和各實驗容器中土壤含水量。

1.3.6 固有生物降解實驗

固有生物降解實驗時，加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的濃度為0.25支/L。取250 mL該浸出液加入到反應(yīng)瓶中，再取27.470 mL活性污泥加入到反應(yīng)瓶中，最后加入活性污泥培養(yǎng)基至總體積為1 L，處理組設(shè)置3個平行。設(shè)置空白對照組和程序?qū)φ战M，其中空白對照組的反應(yīng)瓶中僅加活性污泥和活性污泥培養(yǎng)基，程序?qū)φ战M的反應(yīng)瓶中加入10.00 mL苯胺溶液（濃度為10 000 mg/L），其余實驗過程與處理組相同。測定pH并密封反應(yīng)瓶后，將各反應(yīng)瓶放入呼吸儀，以320 r/min的轉(zhuǎn)速進行攪拌，開始測定氧消耗量。實驗期間每天檢查溫度和攪拌狀況，并讀取耗氧量數(shù)據(jù)，根據(jù)實際耗氧量和理論需氧量的比值，計算固有生物降解率。

1.3.7 魚類富集實驗

在正式實驗前先開展了預(yù)實驗以獲取實驗濃度范圍，根據(jù)加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的斑馬魚急性毒性實驗結(jié)果和實驗樣品定量方法的檢出限，生物富集實驗的加熱卷煙煙支廢棄物浸出液濃度設(shè)為0.05和0.50支/L，同時設(shè)置空白對照。對照組和處理組均設(shè)2個平行組，每組40條斑馬魚。采用流水式實驗裝置，將斑馬魚暴露在動態(tài)的實驗溶液中8 d，于第0、24、48、96、144和192 h時采集魚樣，每次取5尾魚，取出魚樣后快速沖洗并吸干表面水分，低溫冷凍3~5 min致其死亡后，將同一濃度處理組的魚樣合并后稱量，然后進行預(yù)處理。斑馬魚樣的預(yù)處理方法為：稱量魚樣后，稱取硅藻土補至8 g，一并導(dǎo)入研缽中研磨充分后，轉(zhuǎn)入60 mL密閉離心管中，加入15 mL甲醇，密閉超聲提取30 min后，5 000 r/min離心20 min，取上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液后定容至50 mL，過有機相濾膜后轉(zhuǎn)入進樣瓶中進行檢測。同時實驗開始后每天采集暴露水樣，分別從容器的上、中、下層各取10 mL溶液，合并于三角瓶中，混勻，取2 mL過水相濾膜后，轉(zhuǎn)入色譜進樣瓶中，進行煙堿濃度檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

羊角月牙藻生長抑制實驗、大型溞急性活動抑制實驗和斑馬魚急性毒性實驗使用ToxRat Pro（Version 3.3.0）對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。固有生物降解實驗采取公式（1）計算降解率［6］，生物富集性實驗的富集系數(shù)為魚體中煙堿濃度和水體中煙堿濃度的比值。

式中：BOD—供試品生化需氧量，mg；B—接種物對照組氧氣消耗量，mg；TOD—供試品完全被氧化所需的理論耗氧量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊角月牙藻生長抑制實驗結(jié)果

羊角月牙藻在不同濃度的處理組中，生長率出現(xiàn)明顯差異。加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的濃度越高，羊角月牙藻的生長抑制現(xiàn)象越明顯。根據(jù)羊角月牙藻細胞濃度測定結(jié)果，計算空白對照組和各濃度組的平均特定生長率，以及以特定生長率為基礎(chǔ)的抑制率。通過計算得到實驗樣品對藻類生長72 h的半數(shù)生長抑制效應(yīng)濃度（Effect concentration of 50% inhibition of growth rate，ErC50）為1.843支/L，95%置信區(qū)間為1.522~2.210支/L（表1）。

表1 加熱卷煙煙支廢棄物浸出液對羊角月牙藻生長抑制率的影響（均值±標準差）Tab.1 Effects of extracts from used HTP butts on growth inhibition rate of Raphidocelis subcapitata（mean±SD）

2.2 大型溞急性活動抑制實驗結(jié)果

大型溞暴露在0.125支/L低濃度的加熱卷煙煙支廢棄物浸出液中受抑制率較低，但是隨暴露濃度增加，逐漸出現(xiàn)游泳變快、畫圈游動、附肢可動和有附著物結(jié)團等情況，甚至在4支/L的高濃度情況下大型溞的活動完全受到抑制，48 h的累積受抑制率達100%。實驗處理組的累積受抑制數(shù)和受抑制率見表2。通過計算得出加熱卷煙煙支廢棄物浸出液對大型溞的急性活動抑制毒性24 h的EC50值 為1.481支/L，95%置 信 區(qū) 間 為1.195~1.843支/L；48 h的EC50值為0.665支/L，95%置信區(qū)間為0.601~0.736支/L。

表2 加熱卷煙煙支廢棄物浸出液對大型溞累積受抑制率的影響①Tab.2 Effects of extracts from used HTP butts on accumulation inhibition rate of Daphnia magna

2.3 斑馬魚急性毒性實驗結(jié)果

在96 h暴露期內(nèi)，空白對照組、加熱卷煙煙支廢棄物浸出液濃度為0.5和1.0支/L處理組中斑馬魚未表現(xiàn)出中毒癥狀，但濃度為5.0支/L的處理組斑馬魚在暴露6 h后出現(xiàn)游泳異常，24 h后全部中毒死亡。濃度為15.0支/L的處理組斑馬魚在暴露3 h后全部死亡（表3）。根據(jù)最終的實驗結(jié)果，采用二項式法進行計算，加熱卷煙煙支廢棄物斑馬魚的96 h半數(shù)致死濃度（LC50）值為2.236支/L，98.4%的置信區(qū)間為1.0～5.0支/L。

表3 加熱卷煙煙支廢棄物浸出液對斑馬魚累積死亡率的影響Tab.3 Effects of extracts from used HTP butts on cumulative mortality of zebrafish

2.4 蚯蚓急性毒性實驗結(jié)果

蚯蚓暴露在含有加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的人工土壤14 d后，蚯蚓的存活、體質(zhì)量和行為均未發(fā)生明顯異常。實驗暴露期結(jié)束后，未發(fā)現(xiàn)任何處理組蚯蚓出現(xiàn)中毒或死亡（表4）。根據(jù)蚯蚓急性毒性實驗的觀察結(jié)果，在設(shè)置的限制濃度下，加熱卷煙煙支廢棄物浸出液對蚯蚓的急性毒性14 d的LC50＞60支/kg（人工土壤干質(zhì)量）。

表4 加熱卷煙煙支廢棄物浸出液對蚯蚓的影響（均值±標準差）Tab.4 Effects of extracts from used HTP butts on earthworms（mean±SD）

2.5 固有生物降解實驗結(jié)果

加熱卷煙煙支廢棄物的浸出液在活性污泥中的微生物作用下，在第1~12 d內(nèi)生物需氧量快速上升，后續(xù)實驗周期內(nèi)生物需氧量也穩(wěn)步上升，這說明加熱卷煙煙支廢棄物浸出液發(fā)生了生物降解，并且在實驗早期降解較為迅速。統(tǒng)計計算后的實驗結(jié)果表明，加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的28 d累計生物降解率為81.09%，參照物苯胺28 d的累計生物降解率為80.85%（圖1）。苯胺0~4 d的固有生物降解曲線顯示生物降解率為負值，推測原因為苯胺的降解初期階段，其中間產(chǎn)物可能對活性污泥中的微生物略有抑制效應(yīng)，其耗氧量略低于空白值，所以結(jié)果呈現(xiàn)負值；后期隨苯胺降解速率的提高，進入降解期，該抑制作用產(chǎn)生的影響可以忽略。

圖1 加熱卷煙煙支廢棄物浸出液處理組和對照組的固有生物降解曲線Fig.1 Inherent biodegradation curves for extracts from used HTP butts and the control

2.6 魚類富集實驗結(jié)果

生物富集性是根據(jù)暴露水體和斑馬魚體內(nèi)的加熱卷煙煙支廢棄物浸出液中關(guān)注成分——煙堿濃度進行測算。本研究中采用穩(wěn)態(tài)時斑馬魚體中實驗樣品濃度和暴露水體中實驗樣品濃度的比值，計算生物富集系數(shù)BCF（Bio-concentration factors），然后取每個濃度組中兩個平行組的均值，得到0.05和0.50支/L的加熱卷煙煙支廢棄物浸出物中煙堿對斑馬魚的生物富集性結(jié)果分別為4.74和4.94（圖2和圖3）。從富集動態(tài)曲線看，斑馬魚體內(nèi)煙堿濃度與暴露水體中的煙堿濃度在第3天基本達到動態(tài)平衡，后續(xù)暴露期間斑馬魚體內(nèi)的煙堿濃度無明顯增加。

圖2 0.05支/L濃度組中煙堿的BCF-時間曲線Fig.2 BCF-time curves of nicotine at a concentration of 0.05 cig/L

圖3 0.50支/L濃度組中煙堿的BCF-時間曲線Fig.3 BCF-time curves of nicotine at a concentration of 0.50 cig/L

3 討論

近年來新型煙草制品中的加熱卷煙煙支廢棄物，也逐漸進入生態(tài)毒性研究的領(lǐng)域。Baran等［8］對加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的生態(tài)毒性實驗研究結(jié)果表明，加熱卷煙煙支廢棄物的浸出液具有一定的微生物抑制毒性，影響微生物分解污染物的能力。本研究中也發(fā)現(xiàn)加熱卷煙煙支廢棄物對環(huán)境中的羊角月牙藻有一定的生長抑制作用，這可能與加熱卷煙使用過后，煙支廢棄物中殘留了部分煙堿有關(guān)。

本研究中選取的三級水生生物物種（羊角月牙藻、大型溞和斑馬魚）中，大型溞是水生生態(tài)毒性中對加熱卷煙浸出液的毒性較為敏感的物種，其EC50最小，為0.665支/L。加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的斑馬魚急性毒性96 h的LC50值為2.236支/L，表現(xiàn)出一定的水生魚類毒性。加熱卷煙煙支廢棄物的浸出液具有一定的水生毒性，但不同水生生物的毒性大小存在差異。

陸生生物毒性實驗中，在加熱卷煙的蚯蚓急性毒性實驗中發(fā)現(xiàn)，在高達60支/kg（人工土壤干質(zhì)量）浸出液的濃度下，暴露長達14 d，也未發(fā)現(xiàn)任何蚯蚓出現(xiàn)死亡或者中毒癥狀，這說明加熱卷煙煙支廢棄物的陸生生物毒性可能較小。

對加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的生物降解性進行研究發(fā)現(xiàn)，在本實驗條件下，加熱卷煙煙支廢棄物的浸出液具有良好的固有生物降解性，其在實驗的28 d內(nèi)有80%以上發(fā)生了生物降解。加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的環(huán)境風(fēng)險性與其在環(huán)境中存在的時間相關(guān)，環(huán)境中存在時間越短（浸出液發(fā)生生物降解，轉(zhuǎn)為無機物），其對環(huán)境的潛在風(fēng)險相對越低。

關(guān)于加熱卷煙煙支廢棄物中煙堿的生物富集性文獻報道不多，一般用生物富集因子（BCF，Bio-concentration factor）表示煙堿在魚體內(nèi)的富集程度。Hansch等［9］根據(jù)煙堿的正辛醇-水分配系數(shù)（lgKow=1.17）預(yù)估的魚體中煙堿的BCF為3。這與本實驗中的BCF值（4.74）接近。

從上述實驗結(jié)果可以得出，加熱卷煙煙支廢棄物的浸出液具有一定的水生生物毒性，但陸生生物毒性相對較小。加熱卷煙煙支廢棄物浸出液具有良好的生物降解性，且浸出液中的關(guān)注成分煙堿屬于低富集性物質(zhì)［10］，通過合理控制加熱卷煙煙支廢棄物進入水體環(huán)境，可降低加熱卷煙煙支廢棄物的環(huán)境風(fēng)險。進一步研究加熱卷煙煙支廢棄物的環(huán)境暴露量，以及其他生物物種的急性毒性作用或慢性毒性作用，將可進一步明確和評估加熱卷煙煙支廢棄物的環(huán)境風(fēng)險［11-12］。

4 結(jié)論

本實驗條件下，加熱卷煙煙支廢棄物的浸出液具有一定的水生生物急性毒性，但無明顯的陸生生物急性毒性，加熱卷煙煙支廢棄物浸出液具有固有生物降解性，且加熱卷煙煙支廢棄物浸出液中的關(guān)注成分——煙堿富集性低，因此加熱卷煙煙支廢棄物浸出液的環(huán)境風(fēng)險相對較小。