付學明,王文杰,宋自芳

付學明,武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院疼痛科 湖北省孝感市 432100

王文杰,宋自芳,華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院肝膽外科,湖北省武漢市 430022

0 引言

生物體內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)均需經(jīng)過后期合成和共價修飾方能發(fā)揮功能，化學修飾是調(diào)節(jié)大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的高效性方法.高通量測序技術(shù)表明，RNA修飾在基因選擇性表達中發(fā)揮關鍵性調(diào)節(jié)作用[1].近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了170多種不同類型的RNA化學修飾，它們分別參與編碼和非編碼RNA的修飾過程[2].在這些修飾中，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）被認為是自19世紀70年代發(fā)現(xiàn)以來真核生物mRNA中最豐富最具特征性的內(nèi)部修飾[3].RNA不僅是蛋白質(zhì)合成的中間體或效應分子，還可以通過多種其他非編碼RNA對基因表達產(chǎn)生直接的功能作用.

RNA的動態(tài)修飾使得細胞能夠?qū)ν獠凯h(huán)境的變化做出快速反應，而適應不斷變化微環(huán)境（如壓力或化療藥物的刺激）的能力對于腫瘤細胞存活至關重要.近年來研究表明，通過調(diào)控多種RNA代謝過程，RNA修飾成為癌癥中重要的新興調(diào)節(jié)劑[4，5].越來越多的證據(jù)表明，多種m6A調(diào)節(jié)蛋白的表達異常在人類腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用[4，6].RNA修飾異常變化在功能上常常與細胞增殖、分化、應激適應、侵襲和對化療的耐藥等有關.因此，在癌細胞中靶向異常的RNA修飾有望成為治療腫瘤的有效方法[7].

在這篇綜述中，我們討論了包括m6A、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、N1-甲基腺苷（1-methyladenosine，m1A）、7-甲基鳥嘌呤（N7-methylguanosine，m7G）和Pseudouridine在內(nèi)的多種RNA化學修飾，并對其在消化道腫瘤中的作用進行了歸納和總結(jié)（表1）.

表1 幾種RNA化學修飾在消化道腫瘤中的作用

1 m6A修飾

1.1 m6A修飾及其調(diào)節(jié) m6A修飾是真核細胞中最豐富的RNA化學修飾，參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程中多種基本生物學過程，如RNA剪接、核轉(zhuǎn)運、翻譯等.高通量測序技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展揭示了m6A具有以下特征[4，8]:僅部分RNA含有m6A修飾，在哺乳動物分離出的RNA中僅有約0.1%-0.4%的腺苷存在m6A修飾，約占甲基化核糖核苷酸總量的50%;m6A修飾通常出現(xiàn)在終止密碼子和3’UTR區(qū)附近;m6A修飾主要發(fā)生在[G/A/U] [G/A] m6A C [U/A/C]的共有序列.此外，m6A修飾也存在于前體mRNA和長鏈非編碼RNA中[9].

m6A修飾的調(diào)節(jié)器可分為3種類型:“Writers”，“Erasers”，“Readers”.“Writers”即甲基轉(zhuǎn)移酶，能將甲基轉(zhuǎn)移至RNA特定位點上.“Erasers”也稱為脫甲基酶，主要作用是去除m6A修飾.“Readers”為RNA結(jié)合蛋白，參與識別m6A，結(jié)合RNA并實現(xiàn)相應的功能.

1.1.1 “Writers”:m6A在RNA上的沉積主要受到甲基轉(zhuǎn)移酶樣分子3（methyltransferase-like 3，METTL3）-METTL14復合物催化[10]，其中METTL3充當主要的催化亞基，METTL14充當識別底物的RNA結(jié)合支架.METTL3通過其甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域催化腺苷向m6A的轉(zhuǎn)化，而METTL14負責RNA底物的識別，因此m6A修飾過程需要METTL3–METTL14復合物的參與.此外，RNA結(jié)合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）作為甲基轉(zhuǎn)移酶復合體組成中的重要銜接子，負責將復合體募集至mRNA中的靶位點上.調(diào)節(jié)蛋白Wilms腫瘤1相關蛋白（wilms tumor 1-associating protein，WTAP）和病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA）在復合體形成過程中發(fā)揮作用[11].含鋅指CCCH域的蛋白質(zhì)13（Zinc Finger CCCH-Type Containing 13，ZC3H13）充當銜接子RBM15和WTAP之間的橋梁[12].最近，一項新的研究將METTL16鑒定為人類細胞中的另一種活性m6A甲基轉(zhuǎn)移酶[13]，METTL16可以使特定的mRNA甲基化，從而調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移過程中的共底物S-腺苷甲硫氨酸以及mRNA剪接相關的U6小核RNA的合成.此外，負責18S和28S rRNA的m6A修飾酶分別是METTL5-tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶112（TRNA Methyltransferase Subunit 11-2，TRMT11-2）復合物[14]和含鋅指CCHC結(jié)構(gòu)域的蛋白4（Zinc Finger CCHC-Type Containing 4，ZCCHC4）[15].

1.1.2 “Erasers”:m6A修飾過程是可逆的，其調(diào)節(jié)依賴于特定甲基轉(zhuǎn)移酶和脫甲基酶構(gòu)成的協(xié)調(diào)動態(tài)網(wǎng)絡.當前已有報道的兩種m6A去甲基酶分別是脂肪和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）和α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同系物5（alpha-ketoglutaratedependent dioxygenase AlkB homolog 5，ALKBH5）[16，17].FTO和ALKBH5的缺乏或過表達都會改變細胞中的m6A水平.此外，Ueda Y等人的研究還發(fā)現(xiàn)了該家族的另一個成員ALKBH3[18]，ALKBH3在細胞中更優(yōu)先作用于tRNA的m6A修飾過程.由于AlkB亞家族的其他成員功能未知，因此m6A修飾如何選擇性地、動態(tài)地靶向轉(zhuǎn)錄組特定區(qū)域仍然有待進一步了解.

1.1.3 “Readers”:“Readers”能特異性識別并結(jié)合RNA上的m6A位點，進而參與目標RNA的修飾與調(diào)控[19].部分m6A閱讀器包含一個共同的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即YTH結(jié)構(gòu)域，其中包括含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白1（YTH Domain Containing 1，YTHDC1）和YTHDC2以及含YTH結(jié)構(gòu)域家族的蛋白1（YTH Domain-Containing Family Protein 1，YTHDF1）、YTHDF2和YTHDF3[20].YTHDF1通過作用于基因啟動子區(qū)域來增強靶基因的翻譯和蛋白質(zhì)合成過程.YTHDF2通過選擇性結(jié)合m6A修飾的mRNA后將其募集到衰變位點進而誘導其降解.YTHDF3可通過作用于YTHDF1增強翻譯過程，還可通過結(jié)合YTHDF2進而促進RNA降解.YTHDC1參與RNA剪接和轉(zhuǎn)運過程[21].YTHDC2能夠提高RNA翻譯效率，但會降低其豐度[22].胰島素樣生長因子IGF2BPs可以與m6A結(jié)合并起到閱讀器的作用，IGF2BPs通過增強RNA穩(wěn)定性來促進基因表達[23].1.2 m6A修飾在消化道腫瘤中的作用 m6A修飾在多種人類腫瘤中發(fā)揮重要作用，由于腫瘤中m6A調(diào)控子的異常改變引起癌基因或抑癌基因mRNA的m6A修飾變化，進而上調(diào)癌基因表達或下調(diào)抑癌基因表達.

METTL3和METTL14構(gòu)成的復合體參與絕大多數(shù)mRNA上m6A修飾的調(diào)控，該復合體在多種消化道腫瘤中發(fā)揮重要作用.在肝細胞癌中，高表達的METTL3通過YTHDF2介導的RNA降解抑制SOCS2的表達，敲低METTL3會抑制肝癌細胞增殖、集落形成和遷移能力[24].此外，肝細胞癌中下調(diào)的METTL14與患者無復發(fā)生存率顯著相關，METTL14通過與DGCR8相互作用，以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)miRNA 126進程，進而影響腫瘤轉(zhuǎn)移[25].胃癌中高表達的METTL3是一種不良預后因素，敲低METTL3表達能顯著抑制腫瘤細胞增殖和遷移能力[26].在結(jié)腸癌中，METTL3通過促進EGFR和TAZ的翻譯促進腫瘤細胞的生長、存活和侵襲[27].

m6A去甲基酶的失調(diào)也與消化道腫瘤緊密相關.在胰腺癌中，F(xiàn)TO通過降低癌基因MYC和轉(zhuǎn)錄因子bHLH的m6A水平增強其穩(wěn)定性，進而影響癌細胞的增殖過程[28].ALKBH5則通過減少lncRNA NEAT1的甲基化修飾水平促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[29].

m6A修飾調(diào)節(jié)的“Readers”功能缺陷與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關.RNA解旋酶YTHDC2可作為結(jié)腸癌患者的有效診斷標志物和潛在治療靶點，YTHDC2通過促進HIF-1α的翻譯促進結(jié)腸腫瘤轉(zhuǎn)移[30].沉默YTHDF1能顯著抑制結(jié)直腸癌細胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑的活性，并抑制腫瘤生長[31].YTHDF2在胰腺癌中能夠促進癌細胞增殖并抑制其遷移和侵襲[32].

2 m5C修飾

2.1 m5C修飾及其調(diào)節(jié) m5C修飾廣泛存在于mRNA，rRNA，tRNA，ncRNA 中，其中以真核生物的tRNA和rRNA中最為豐富.在不同RNA亞型中m5C修飾發(fā)揮著不同的功能.在tRNA中，m5C通過調(diào)節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定維持翻譯的準確性[33].

負責RNA m5C修飾的酶包括NSUN家族的NSUN1至NSUN7和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2（DNA Methyltransferase-2，DNMT2）[34].NSUN1和NSUN5參與調(diào)節(jié)28S rRNA m5C修飾，而NSUN3和NSUN4分別調(diào)節(jié)線粒體tRNA和rRNA m5C修飾.NSUN2和DNMT2則調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中tRNA m5C修飾，而NSUN7則靶向eRNAs.有報道表明，m5C可以被ALKBH1在線粒體tRNA處轉(zhuǎn)變形成f5C[35].

2.2 m5C修飾在消化道腫瘤中的作用 m5C調(diào)控子也在多種消化道腫瘤中發(fā)揮著重要作用.研究表明，NSUN2基因在結(jié)直腸癌中的拷貝數(shù)顯著升高，RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2與癌基因MYC相關聯(lián)，當Myc蛋白被激活后，NSUN2的表達也隨之上調(diào)[36].一種來源于NSUN2基因編碼序列的環(huán)狀RNA circNSUN2（hsa_circ_0007380）在結(jié)直腸癌中表達升高，通過體內(nèi)PDX實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的circNSUN2能促進腫瘤肝轉(zhuǎn)移進程[37].

迄今為止，尚未開發(fā)出特異性的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑.然而，有研究顯示[38]，氮雜胞苷作為一種新型抗腫瘤藥物，能夠通過抑制Dmnt2介導的m5C修飾降低癌細胞的增殖能力，這表明減少tRNA的m5C修飾可能是一種有效的癌癥治療策略.

3 m1A修飾

3.1 m1A修飾及其調(diào)節(jié) m1A修飾是指將甲基連接到RNA腺苷的N1位置而產(chǎn)生.m1A修飾能夠顯著改變RNA結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)-RNA相互作用的強度，進而影響蛋白質(zhì)翻譯過程.TRM10和TRM6-TRM61復合體介導了tRNA的m1A修飾過程[39].在28S rRNA中也同樣檢測到m1A修飾的存在[40].由于m1A抗體缺乏特異性等原因，研究人員在細胞質(zhì)mRNA上檢測到的 m1A修飾定位存在一定爭議，但更多的結(jié)論仍然支持m1A可能以相對較高的化學計量比存在于一小部分胞質(zhì)mRNA上[41，42].YTH蛋白家族可以與m1A呈現(xiàn)低親和力結(jié)合，故被認為是細胞中潛在的m1A閱讀器[43].ALKBH1和ALKBH3作為脫甲基酶參與RNA中m1A修飾調(diào)節(jié)過程.

3.2 m1A修飾在腫瘤中的作用 由于難以在轉(zhuǎn)錄組上定位m1A修飾以及對其相關調(diào)控子的認知較少等原因，目前對于m1A修飾在癌癥中發(fā)揮的作用了解仍然有限.研究表明[44]，ALKBH3可促進癌細胞的增殖，遷移和侵襲，體內(nèi)研究證實，ALKBH3對腫瘤異種移植物的生長具有調(diào)節(jié)作用.m1A相關調(diào)控基因在消化道腫瘤中的異常表達與患者預后密切相關，胃癌、結(jié)直腸癌以及肝細胞癌中過表達的ALKBH1與患者整體生存率成負相關，食管癌、結(jié)直腸癌中低表達的ALKBH3與大多數(shù)患者整體生存率下降相關[45].

4 m7G修飾

4.1 m7G修飾及其調(diào)節(jié) 表觀遺傳修飾m7G最初被發(fā)現(xiàn)存在于真核生物mRNA、tRNA和rRNA內(nèi)部.表征m7G甲基化修飾最典型的酶是METTL1，在tRNA中，METTL1-WDR4復合物介導的m7G修飾可保持其結(jié)構(gòu)完整[46].rRNA上的m7G修飾由Williams-Beuren綜合征染色體22區(qū)蛋白（Williams-Beuren syndrome chromosome region 22，WBSCR22）介導，但其作用尚不完全清楚，rRNA上的m7G修飾可能參與了核糖體的成熟，但對翻譯影響不大[47].mRNA內(nèi)的m7G修飾在5’UTR處富集，并伴隨應激改變出現(xiàn)動態(tài)調(diào)節(jié)，其作用是促進翻譯過程[48].Pandolfini等[49]人采用化學反應法來檢測miRNA中的m7G修飾，并鑒定出部分具有抑制腫瘤遷移作用的miRNA中存在m7G修飾.METTL1介導的RNA甲基化通過破壞前體miRNA轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）內(nèi)的抑制性二級結(jié)構(gòu)來增強let-7 miRNA加工過程，這表明METTL1依賴性的m7G修飾是調(diào)節(jié)miRNA結(jié)構(gòu)以及生物學功能的重要修飾途徑.

4.2 m7G修飾在腫瘤中的作用 作為m7G重要的調(diào)控子，METTL1在肝癌中表達顯著上調(diào)，且與患者的不良預后相關，并通過PTEN/AKT信號通路表現(xiàn)出致癌活性[50].在結(jié)直腸癌中，METTL1發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用[51]，此外，過表達的METTL1還通過調(diào)控miR-149-3p/S100A4/p53軸來增加結(jié)直腸癌細胞對順鉑的化學敏感性[52].這些結(jié)果表明維持高水平的功能性tRNA可能是METTL1在癌細胞中發(fā)揮作用的關鍵.盡管METTL1對tRNA的作用可能是促癌的，但尚無直接證據(jù)證實m7G修飾在癌細胞中發(fā)揮作用.

研究表明[53]，結(jié)直腸癌組織中WBSCR22表達顯著升高，上調(diào)的WBSCR22預示患者不良預后，敲低WBSCR22可顯著提高結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性，而過表達WBSCR22則使得細胞抗性明顯增加.敲低WBSCR22表達增加了奧沙利鉑誘導的細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生以及活性氧誘導的8-氧鳥嘌呤氧化損傷積累，這使得癌細胞對于奧沙利鉑治療變得更為敏感.

5 假性尿苷修飾

5.1 假性尿苷修飾及其調(diào)節(jié) 假性尿苷修飾是在mRNA，tRNA，rRNA，snRNA和lncRNA中大量存在的另一種RNA修飾.當前的分子生物學技術(shù)能夠非常精準的檢測到這種修飾變化.在人類細胞系中，mRNA和lncRNA中假性尿苷（pseudouridine，ψ）修飾所占比例約為30%-84%[54].大部分mRNA中的ψ在對環(huán)境應激的反應中起調(diào)節(jié)作用.ψ的存在能夠增加RNA骨架的剛性，影響其熱力學穩(wěn)定性和空間構(gòu)象，從而使RNA結(jié)構(gòu)和功能更加穩(wěn)定.ψ修飾在tRNA中參與維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在rRNA中參與對核糖體的組裝.ncRNA端粒酶RNA組分（telomerase RNA Component，TERC）中ψ修飾可能與其端粒酶的活性有關.ψ導入真核RNA的過程是由RNA依賴或非依賴性的假尿苷合酶（PUS）介導的.

5.2 ψ修飾在腫瘤中的作用 與假尿苷修飾缺陷相關研究最多的疾病之一是與假尿苷合酶（dyskerin pseudouridine synthase 1，DKC1）失活突變相關的先天性角化不良癥（dyskeratosis congenita，DC），而X-DC病患者的一個特征是具有更高的癌癥發(fā)病風險.DKC1活性的缺乏會導致端粒酶活性受損和核糖體上mRNA翻譯障礙，進而造成細胞復制潛能的降低和過早衰老.DKC1的異常改變與結(jié)直腸癌、肝癌等均有聯(lián)系.在肝癌細胞中，snoRNA24的異常表達介導了18S rRNA中U609和U863位的假尿苷化，這種變化通過改變tRNA選擇、核糖體延伸和翻譯效率影響癌細胞的存活[55].結(jié)直腸癌中rRNA上減少的ψ修飾則通過影響其與核糖體P位點的相互作用改變了癌細胞中的翻譯過程[56].

6 結(jié)論

RNA修飾在基因表達過程中作為關鍵性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因素發(fā)揮著重要作用，研究人員逐漸認識到其相互作用的功能網(wǎng)絡涉及代謝、表觀遺傳學和染色質(zhì)重塑以及免疫系統(tǒng)等多領域.盡管關于表轉(zhuǎn)錄組的研究已有很大進展，但大多數(shù)研究僅集中在mRNA中m6A修飾的生物學功能上，而表轉(zhuǎn)錄組包括170多種修飾編碼和非編碼RNA的化學修飾，因此，其他百余種RNA修飾與編碼和非編碼RNA的關聯(lián)研究仍有待探索.

探究各種RNA修飾的的具體生物學功能，首先需要開發(fā)用于快速和定量檢測RNA修飾的系統(tǒng)性方法和工具.當前已有的大部分測序方法都基于第二代測序技術(shù)，無法很好地識別RNA上的化學修飾.研究人員在檢測特定的RNA修飾時，常需要使用基于特定抗體的免疫沉淀技術(shù)或化學標記以及RNA配對的獨特堿基修飾特性等間接方法對RNA修飾進行檢測.這些方法固然具備良好的可行性，但受限于技術(shù)和不完備的算法等原因，其再現(xiàn)率仍然較低.因此，未來針對各種RNA修飾的檢測技術(shù)和方法仍然需要進一步研究和探索.

RNA修飾的異常改變通過調(diào)控mRNA翻譯和蛋白質(zhì)合成過程參與多種消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展.表轉(zhuǎn)錄組學領域的最新進展已將表轉(zhuǎn)錄組學機制的組成部分的重編程與癌癥聯(lián)系起來[57].隨著最近開發(fā)的針對m6A修飾蛋白的有效抑制劑的出現(xiàn)，干預并調(diào)節(jié)RNA修飾過程有望成為一種新的表轉(zhuǎn)錄組治療方式.m6A、m5C或ψ等在內(nèi)的多種RNA修飾參與調(diào)控干細胞功能和應激狀態(tài)下的細胞存活能力，針對這些RNA修飾的調(diào)節(jié)可能對于減少腫瘤細胞化療耐藥性和腫瘤復發(fā)具有重要價值.在特定的細胞類型或腫瘤微環(huán)境中鑒定出準確表轉(zhuǎn)錄組生物標志物并確定異常修飾的致癌或抑癌作用，對于尋找確切的分子靶標和開發(fā)高選擇性和有效性的治療方法具有重要意義.

綜上所述，在消化道腫瘤中，表轉(zhuǎn)錄水平和RNA修飾的動態(tài)變化作為有臨床價值的新型生物標志物具有良好前景.同時，參與調(diào)節(jié)RNA修飾的多種酶也可能作為致癌或抑癌因子而發(fā)揮作用，并成為新的治療靶點.未來，基于表轉(zhuǎn)錄組特征的精準醫(yī)療可能會被用于患者特定腫瘤類型的診斷和治療.