鄭曉媛　余志杰　王璇　周世文

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）21-2619-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.10

摘 要 目的：研究何首烏主要成分的肝毒性，并基于代謝酶探討其毒性機(jī)制。方法：采用ADMETlab 2.0平臺(tái)預(yù)測(cè)何首烏的5種主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒(méi)食子酸對(duì)肝、皮膚、心臟等的毒性或致癌作用，并評(píng)估這些成分對(duì)細(xì)胞色素P450酶系（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的影響;檢測(cè)不同濃度（10、20、40、80 μmol/L）的大黃素、大黃酸、二苯乙烯苷、沒(méi)食子酸對(duì)人正常肝細(xì)胞L02存活率的影響;以膽紅素為底物，采用體外反應(yīng)體系考察何首烏主要成分對(duì)葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1家族多肽A1（UGT1A1）活性的影響。結(jié)果：何首烏主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、沒(méi)食子酸對(duì)肝的毒性作用均較強(qiáng)。大黃素、大黃素甲醚對(duì)CYP1A2的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作用為中等;大黃酸對(duì)CYP1A2、CYP2C9的抑制作用為中等，二苯乙烯苷和沒(méi)食子酸對(duì)上述各酶的抑制作用均較弱。大黃素（40、80 μmol/L）和沒(méi)食子酸（40、80? ?μmol/L）均可顯著降低L02細(xì)胞的存活率（P<0.01）。5、10、20、40、80 μmol/L的大黃素和沒(méi)食子酸（5 μmol/L的大黃素除外）對(duì)UGT1A1酶的抑制率均顯著升高（P<0.01），大黃素對(duì)UGT1A1酶的抑制作用為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。結(jié)論：何首烏主要成分大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等具有肝毒性，其作用機(jī)制可能與抑制CYP1A2、CYP2C9活性以及競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽紅素代謝限速酶UGT1A1的活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 何首烏;大黃素;二苯乙烯苷;大黃酸;沒(méi)食子酸;細(xì)胞色素P450酶;葡糖醛酸酶;肝毒性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the hepatotoxicity of main components of Polygonum multiflorum， and investigate its toxic mechanism based on metabolic enzymes. METHODS： ADMETlab 2.0 platform was used to forecast the toxic or carcinogenic effects of emodin， physcion， rhein， stilbene glycoside and gallic acid on liver， skin and heart. The effects of those components on cytochrome P450 enzyme system （CYP1A2， CYP2C9， CYP2C19， CYP2D6， CYP3A4） were evaluated. The effects of different concentrations of emodin， rhein， stilbene glycoside and gallic acid （10， 20， 40， 80 μmol/L） on the survival rate of normal hepatocyte L02 were detected. The effects of major components of P. multiflorum on the activity of UGT1A1 enzyme were studied by in vitro reaction system， using bilirubin as substrate. RESULTS： Main components of P. multiflorum， ie. emodin， physcion， rhein and gallic acid， showed strong toxic effects on the liver， while stilbene glycosides possessed weak toxic effects on the liver. Emodin and physcion had strong inhibitory effects on CYP1A2 and medium inhibitory effects on CYP2C9， CYP2D6 and CYP3A4; rhein showed medium inhibitory effects on CYP1A2 and CYP2C9， while stilbene glycoside and gallic acid possessed weak inhibitory effects on the above enzymes. Emodin （40， 80 μmol/L） and gallic acid （40， 80 μmol/L） could significantly reduce the survival rate of L02 cells （P<0.01）. The inhibition rate of 5， 10， 20， 40， 80 μmol/L emodin and gallic acid （except for 5? ? ? μmol/L emodin） on UGT1A1 enzyme increased significantly （P<0.01）， and the inhibition effect of emodin on UGT1A1 enzyme was reversible competitive inhibition. CONCLUSIONS： The main components of P. multiflorum， ie. emodin， rhein and physcion， are hepatotoxic; the mechanism of it may be associated with inhibiting the activity of CYP1A2 and CYP2C9 and competitively blocking rate-limiting enzyme UGT1A1 in the process of bilirubin metabolism.

KEYWORDS? ?Polygonum multiflorum; Emodin; Stilbene glycosides; Rhein; Gallic acid; Cytochrome P450 enzyme; Glucuronidase; Hepatotoxicity

隨著人類生活方式和使用中藥的目的、方式發(fā)生改變，中藥的安全性問(wèn)題日益凸顯，既往認(rèn)為“補(bǔ)益養(yǎng)身”的何首烏及其制劑引起的肝損傷也屢見報(bào)道[1]。何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multliflorum Thunb.的干燥塊根，具有抗衰老、降血脂、抗癌、抗炎、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)等作用[2];但也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，何首烏提取物可能導(dǎo)致肝毒性、腎毒性和胚胎毒性[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，何首烏的主要成分有二苯乙烯苷、蒽醌類（包括大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等）、鞣質(zhì)（包括沒(méi)食子酸等）和磷脂等，其中大黃素可通過(guò)刺激活性氧簇（ROS）的釋放，啟動(dòng)外源性和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞凋亡[4-5];二苯乙烯苷、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、順式二苯乙烯苷、兒茶素等5種成分與何首烏的毒性具有較強(qiáng)的相關(guān)性[5]，但具體作用機(jī)制尚不明確。

探討藥物對(duì)代謝酶的影響是藥物肝毒性研究的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，藥物在人體內(nèi)的代謝途徑可分為Ⅰ相代謝途徑和Ⅱ相代謝途徑，其中Ⅰ相代謝途徑主要是氧化和羥基化，Ⅱ相代謝途徑主要是硫酸酯化和葡萄糖醛酸化[6]。細(xì)胞色素 P450（CYP450）酶系是Ⅰ相代謝途徑中的主要酶系，可影響多種藥物代謝;葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGTs）是Ⅱ相代謝途徑中的主要酶系，對(duì)膽紅素和多種藥物的代謝具有重要作用[6-7]。其中膽紅素經(jīng)血液循環(huán)至肝臟后，可通過(guò)UGTs形成膽紅素葡萄糖醛酸化合物，進(jìn)一步被排泄至膽囊及腸道進(jìn)行清除;葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1家族多肽A1（UGT1A1）為該過(guò)程的限速酶，當(dāng)其受到抑制時(shí)，可導(dǎo)致膽紅素的清除減慢，從而表現(xiàn)出肝內(nèi)膽汁淤積，進(jìn)而損傷肝細(xì)胞[7]。

基于此，筆者首先采用ADMETlab 2.0平臺(tái)預(yù)測(cè)何首烏主要成分（大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒(méi)食子酸）對(duì)肝、皮膚、心臟的毒性或致癌作用，并評(píng)估這些成分對(duì)細(xì)胞色素P450酶系的影響;采用人正常肝細(xì)胞L02驗(yàn)證何首烏主要成分的肝毒性，進(jìn)而在體外反應(yīng)體系層面研究何首烏主要成分對(duì)UGT1A1酶活性的影響，以期從代謝角度闡明何首烏肝毒性的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Multiskan SkyHigh型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、17R型高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），AE240 型電子天平（德國(guó)Sartorius公司），DK 600型電熱恒溫水槽 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），F(xiàn)8型超細(xì)勻漿機(jī)（德國(guó) Fluko公司） 。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用大黃素（批號(hào)E7881）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;大黃酸、二苯乙烯苷、沒(méi)食子酸（批號(hào)分別為201812、201903、201909）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（批號(hào)分別為31800022、10100147）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; CCK-8試劑盒（批號(hào)C0038）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; HLA- UGT1A1酶（批號(hào)456411）購(gòu)自美國(guó)Gentest公司;膽紅素測(cè)定試劑盒（批號(hào)ab235627）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;膽紅素對(duì)照品（批號(hào)100077-201806，含量99.3%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純化水。

1.3 細(xì)胞

人正常肝細(xì)胞L02購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 何首烏主要成分的毒性預(yù)測(cè)

參考文獻(xiàn)[8-9]的方法，采用ADMETlab 2.0平臺(tái)（https：//admet.scbdd.com/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。首先，將何首烏的5種主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒(méi)食子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式輸入該平臺(tái)，得出各成分的SMILE表達(dá)式;然后預(yù)測(cè)各成分對(duì)肝、皮膚、心臟、呼吸系統(tǒng)、芳烴受體的毒性作用及致癌作用，并評(píng)估這些成分對(duì)CYP450酶系（包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的抑制作用。當(dāng)評(píng)估預(yù)測(cè)值為0～<0.3時(shí)，提示成分的毒性/致癌/抑制作用弱;當(dāng)該預(yù)測(cè)值為0.3～<0.7時(shí)，提示成分的毒性/致癌/抑制作用為中等;當(dāng)該預(yù)測(cè)值為0.7～1.0 時(shí)，提示成分的毒性/致癌/抑制作用較強(qiáng)。

2.2 何首烏主要成分對(duì)L02細(xì)胞活性的影響考察

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將L02細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，以胰酶消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 細(xì)胞存活率的檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，然后分為大黃素不同濃度組（10、20、40、80 μmol/L，濃度參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行設(shè)置，下同）、大黃酸組不同濃度組（10、20、40、80 μmol/L）、二苯乙烯苷不同濃度組（10、20、40、80? ?μmol/L）、沒(méi)食子酸不同濃度組（10、20、40、80 μmol/L），另設(shè)不加藥物只加細(xì)胞的空白組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔（大黃素甲醚與大黃素結(jié)構(gòu)類似，故本實(shí)驗(yàn)不設(shè)置大黃素甲醚組）。待細(xì)胞貼壁后，各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)24 h，再加入CCK-8試劑10 μL培養(yǎng)1 h，然后采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（OD空白組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD空白組×100%]。細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)束后，取各組細(xì)胞適量分別于顯微鏡下觀察形態(tài)，并以大黃素不同濃度組細(xì)胞為代表拍照保存（其余組別的細(xì)胞顯微圖略）。

2.3 何首烏主要成分對(duì)UGT1A1酶活性的影響

2.3.1 UGT1A1酶抑制率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11-12]方法并進(jìn)行改進(jìn)，制備尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）-緩沖系統(tǒng)，然后分為大黃素不同濃度組（5、10、20、40、80 μmol/L，濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，下同）、大黃酸不同濃度組（5、10、20、40、80 μmol/L）、沒(méi)食子酸不同濃度組（5、10、20、40、80 μmol/L）以及空白組（加酶但不加藥物），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組均以膽紅素（0.2 μg/μL）為反應(yīng)底物，加入U(xiǎn)GT1A1酶（0.5 U/L）1 μL以及相應(yīng)藥物，置于37 ℃恒溫水浴條件下避光反應(yīng)10 min后，加入冰乙腈-甲醇溶液600 μL終止反應(yīng);然后將反應(yīng)液以15 000 r/min離心 25 min，取上清液175 μL加入96孔板中，并根據(jù)膽紅素測(cè)定試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，并計(jì)算酶抑制率[酶抑制率=（OD空白組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD空白組×100%]。

2.3.2 大黃素對(duì)UGT1A1酶動(dòng)力學(xué)的影響考察 以膽紅素系列溶液 （0.125～2 mmol/L）為底物，參考“2.3.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定不同濃度大黃素[0（作為空白對(duì)照）、20、40、80 μmol/L]對(duì)UGT1A1酶的抑制率，采用 Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖法確定大黃素對(duì)UGT1A1酶的反應(yīng)類型[13]。

2.3.3 大黃素對(duì)UGT1A1酶抑制的可逆性考察 參考文獻(xiàn)[14]方法，取UGT1A1酶溶液 （1 U/mL） 0.5 mL與 1 mg大黃素混合，于 37 ℃恒溫水浴條件下預(yù)處理1 h，再置于4 ℃的 0. 1 mol /L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8） 中透析24 h，透析期間每8 h更換1次磷酸鹽緩沖液，作為大黃素透析組;同時(shí)，設(shè)置只加酶不加大黃素的空白透析組。另取UGT1A1酶溶液（1 U/mL） 0.5 mL與1 mg大黃素混合，不進(jìn)行透析，直接置于4 ℃條件下保存 24 h 作為大黃素非透析組;同時(shí)，設(shè)定只加酶不加大黃素的空白非透析組。每組設(shè)5個(gè)平行。透析（或非透析放置）結(jié)束后，將混合溶液分別稀釋10、50、100、500、1 000倍，測(cè)定OD值，并計(jì)算酶相對(duì)活性[酶相對(duì)活性=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組×100%，式中透析或非透析實(shí)驗(yàn)組分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)的透析或非透析空白組]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 何首烏主要成分的毒性預(yù)測(cè)結(jié)果

3.1.1 毒性及致癌作用預(yù)測(cè)結(jié)果 何首烏中的大黃素、大黃素甲醚、大黃酸對(duì)肝、芳烴受體的毒性作用較強(qiáng)，二苯乙烯苷對(duì)皮膚、芳烴受體的毒性作用較強(qiáng);沒(méi)食子酸對(duì)肝、皮膚的毒性作用較強(qiáng)，詳見表1。

3.1.2 酶抑制作用 大黃素、大黃素甲醚對(duì)CYP1A2的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作用中等;大黃酸對(duì)CYP1A2、CYP2C9的抑制作用中等，對(duì)CYP2D6、CYP3A4的抑制作用較弱;二苯乙烯苷和沒(méi)食子酸對(duì)CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作用均較弱;各成分對(duì)CYP2C19的抑制作用均較弱，詳見表2。

3.2 何首烏主要成分對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響

與空白組比較，大黃素40、80 μmol/L組和沒(méi)食子酸40、80 μmol/L組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.01），且具有一定濃度依賴趨勢(shì);大黃酸不同濃度組和二苯乙烯苷不同濃度組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞形態(tài)正常;大黃素不同濃度組細(xì)胞隨給藥濃度的增加，表現(xiàn)出明顯的色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解等，且伴隨發(fā)泡、凋亡小體生成，詳見圖1。

3.3 何首烏主要成分對(duì)UGT1A1酶活性的影響

3.3.1 UGT1A1酶抑制率 大黃素和沒(méi)食子酸不同濃度組（大黃素5 μmol/L組除外）的UGT1A1酶抑制率較空白組均顯著升高（P<0.05或P<0.01），大黃酸不同濃度組的UGT1A1酶抑制率較空白組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表4。

3.3.2 UGT1A1的酶動(dòng)力學(xué) 大黃素對(duì)UGT1A1酶的抑制作用與給藥濃度成正比，酶催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率（Vmax）以及米氏常數(shù)（Km）隨給藥濃度的升高而降低，表明大黃素對(duì)UGT1A1酶的抑制作用類型可能為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，詳見圖2。

3.3.3 UGT1A1酶抑制的可逆性 與空白透析組比較，空白非透析組的UGT1A1酶相對(duì)活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明透析對(duì)UGT1A1酶的清除無(wú)影響;與空白透析組比較，大黃素透析組稀釋10、50倍后的UGT1A1酶相對(duì)活性均顯著降低（P<0.01）;與大黃素非透析組比較，大黃素透析組稀釋10、50倍后的UGT1A1酶相對(duì)活性均顯著降低（P<0.01），詳見圖3。

4 討論

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，患者短期或長(zhǎng)期服用何首烏生品及其炮制品可發(fā)生肝毒性，嚴(yán)重者可發(fā)生肝衰竭[15]。英國(guó)、澳大利亞和加拿大等國(guó)的藥品監(jiān)督管理部門先后發(fā)布了何首烏致肝損傷的警告信息[16]。在我國(guó)，國(guó)家藥物警戒平臺(tái)收到的何首烏及其相關(guān)制劑的不良反應(yīng)報(bào)告例次位居中藥類前列，且多數(shù)以肝損傷為主;另外，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局也屢次發(fā)布警示信息，提示何首烏及其相關(guān)制劑的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)[17-19]。

計(jì)算機(jī)技術(shù)預(yù)測(cè)藥物肝毒性是美國(guó)FDA推薦的常用方法[20]，筆者在本文中采用計(jì)算機(jī)ADMETlab 2.0平臺(tái)對(duì)何首烏的5種主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒(méi)食子酸的各器官毒性及致癌作用進(jìn)行了模擬預(yù)測(cè)（由于藥物致肝損傷可通過(guò)免疫介導(dǎo)途徑損傷全身主要器官，故本文將皮膚、心臟、呼吸系統(tǒng)、芳烴受體均作預(yù)測(cè)分析[1]）。結(jié)果顯示，大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、沒(méi)食子酸對(duì)肝的毒性作用均較強(qiáng)。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，大黃素（40、80 μmol/L）和沒(méi)食子酸（40、80 μmol/L）均可顯著降低L02細(xì)胞的存活率。此外，大黃素、大黃素甲醚對(duì)CYP1A2具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4具有中等抑制作用，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果基本一致[21]。由此推測(cè)，大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等抑制細(xì)胞色素P450酶系的作用可能是何首烏主要成分導(dǎo)致藥物性肝損傷的機(jī)制之一。

何首烏引發(fā)的肝毒性多伴有膽紅素異常升高的表現(xiàn)，膽紅素的代謝與Ⅱ相代謝途徑中的葡萄糖醛酸結(jié)合環(huán)節(jié)有關(guān)，而在葡萄糖醛酸酶的1A1、1A3、1A4、1A5、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10等多個(gè)異構(gòu)體中，代謝膽紅素的酶主要是UGT1A1酶[22]?；诖?，本研究以膽紅素為底物，從體外反應(yīng)體系層面研究何首烏主要成分對(duì)UGT1A1酶活性的影響。結(jié)果顯示，何首烏主要成分大黃素和沒(méi)食子酸（5 μmol/L的大黃素除外）對(duì)UGT1A1酶的抑制率均顯著升高;進(jìn)一步通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和透析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃素對(duì)UGT1A1酶的抑制作用為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。由此筆者推測(cè)，何首烏主要成分大黃素可通過(guò)抑制Ⅱ相代謝途徑中的UGT1A1酶活性，從而增加膽紅素代謝時(shí)間;另外，由于該抑制作用是可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，故筆者推測(cè)在停止給藥后，UGT1A1酶活性可逐漸恢復(fù)。

綜上所述，何首烏主要成分大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、沒(méi)食子酸等具有肝毒性，其作用機(jī)制可能與抑制CYP1A2、CYP2C9活性以及競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽紅素代謝限速酶UGT1A1的活性有關(guān)。

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（收稿日期：2021-09-10 修回日期：2021-10-14）

（編輯：唐曉蓮）