張建偉，劉海燕，劉 瑾，鄧龍飛，劉 力，沈婷婷，喬哥娣，蔣潔瑩

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

生地低聚糖和麥冬多糖組合物（以下稱地麥活性糖）由生地低聚糖和麥冬多糖組成，其中生地低聚糖主要由蔗糖、棉子糖和水蘇糖組成[1]；麥冬多糖主要由35分子果糖和1分子葡萄糖通過化學(xué)鍵連接而成[2]。課題組前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生地低聚糖能顯著改善慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）的氣道病理變化，減輕氣流受阻，有效延緩和逆轉(zhuǎn)COPD的發(fā)生[3]；麥冬多糖能夠保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制心肌缺血造成的自由基生成增加，并清除氧自由基[4]。2020年版《中華人民共和國藥典》中，地黃和麥冬均可用于內(nèi)熱消渴等癥，而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”范疇，課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)地麥活性糖可以降低糖尿病患者血糖，具有良好的臨床應(yīng)用前景。地麥活性糖分別由生地黃和麥冬經(jīng)水煎煮、除雜、膜分子截留分離等制得，制備工藝較復(fù)雜，糖是微生物的一種營養(yǎng)來源，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過程中極容易被微生物污染、霉變，從而影響藥品的安全性和質(zhì)量控制[5]。滅菌是保證中藥臨床安全的有效途徑。不同滅菌方法的滅菌效力與制劑種類和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)密切相關(guān)，滅菌可影響制劑中化學(xué)成分的含量[6-7]。因此，考察不同的滅菌方法對地麥活性糖中指標(biāo)成分果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖含量，以及微生物數(shù)量的影響，旨在為地麥活性糖和其他糖類制劑的滅菌方法提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 Agilent 1100型液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；SEDEX75型蒸發(fā)光散射檢測器（法國SEDERE公司）；TG332A型微量電子分析天平（上海精密科技儀器有限公司）；FA2004B型電子分析天平（上海精密科技儀器有限公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XGL.DW型脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；60Co-γ輻照源（上海核銘輻射科技有限公司）；CA-1390-1型超凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 材料 果糖對照品（批號(hào)：100231-201606，純度：99.7%）、蔗糖對照品（批號(hào)：111507-201704，純度：100%）、水蘇糖對照品（批號(hào)：112031-201701，純度：90.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；棉子糖對照品（批號(hào)：19042322，純度：99.6%）購于上海同田生物技術(shù)有限公司；蛋白胨（批號(hào)：180716）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190424）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190529）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：181228）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：180619）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：180420）均購自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司；生地低聚糖（批號(hào)：20180911，20190418）、麥冬多糖（批號(hào)：20180514，20180524，20180528）由上海中醫(yī)藥大學(xué)制劑實(shí)驗(yàn)室制備；乙腈（色譜純）由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 地麥活性糖滅菌 按照飲片生地黃-麥冬（1∶1），分別精密稱取生地低聚糖（由生地黃經(jīng)過水提、濃縮、HPD100大孔吸附樹脂分離、截留分子量為1 000 Da和150 Da的膜分離等制得）[1]和麥冬多糖（由麥冬經(jīng)過水提、濃縮、80%乙醇兩次醇沉、截留分子量為10 000 Da和1 000 Da的膜分離等制得）[8]，加水超聲溶解，定容，配置成濃度為0.28 g/mL的地麥活性糖水溶液。

2.1.1 煮沸滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180524）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]水溶液于燒杯中，稱質(zhì)量后，加熱煮沸30、60、90、120 min，放至室溫，用水補(bǔ)質(zhì)量，混勻，備用。

2.1.2 100 ℃流通蒸汽滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180514）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]水溶液于口服液體藥用高密度聚乙烯瓶，置脈動(dòng)真空滅菌器中，100 ℃流通蒸汽滅菌60、120 min，備用。

2.1.3 加防腐劑100 ℃流通蒸汽滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180528）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]水溶液，加入適量防腐劑，配制成苯甲酸鈉（3‰）-地麥活性糖水溶液、羥苯乙酯（0.5‰）-地麥活性糖水溶液、山梨酸（2‰）-地麥活性糖水溶液、苯甲酸鈉（3‰）-羥苯乙酯（0.5‰）-地麥活性糖水溶液，置脈動(dòng)真空滅菌器中，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min，備用。

2.1.4 120 ℃流通蒸汽滅菌 分別量取地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180524）+生地低聚糖（批號(hào)：20190418）]水溶液于滅菌錐形瓶中，置脈動(dòng)真空滅菌器中，120 ℃流通蒸汽滅菌15 min，備用。

2.1.560Co-γ射線輻照滅菌 地麥活性糖[麥冬多糖（批號(hào)：20180514）+生地低聚糖（批號(hào)：20180911）]粉末分裝于鋁箔袋，10 kGy60Co-γ射線輻照12 h，備用。

2.2 微生物限度檢查[9]參照2020年版《中華人民共和國藥典》非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，采用“微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）項(xiàng)下平皿法測定滅菌前后各地麥活性糖中需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)；采用“控制菌檢查法”（通則1106）項(xiàng)下平皿法測定樣品中的大腸埃希菌，檢查標(biāo)準(zhǔn)為非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107），結(jié)果見表1。

表1 滅菌對微生物限度檢查結(jié)果的影響（cfu/mL）

由表1知，地麥活性糖在制備過程中未污染霉菌、酵母菌、大腸埃希菌；煮沸、100 ℃流通蒸汽、120 ℃流通蒸汽、60Co-γ射線輻照及加防腐劑后100 ℃流通蒸汽滅菌均可明顯降低地麥活性糖需氧菌總數(shù)，且滅菌時(shí)間越長滅菌效力越好，進(jìn)一步結(jié)合滅菌前后地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量變化，確定最佳滅菌方法。

2.3 果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量測定

2.3.1 溶液配制

2.3.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取適量果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖對照品于2 mL容量瓶中，超聲溶解后定容，搖勻，上述對照品的質(zhì)量濃度分別為0.9、0.9、1.0、2.0 mg/mL。再分別量取果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖對照品溶液300、300、350、600 μL于2 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.13、0.13、0.18、0.59 mg/mL果糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖混合對照品溶液。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 精密移取120 μL滅菌前后的地麥活性糖水溶液于10 mL容量瓶中（或精密稱量0.15 g左右輻射前后的地麥活性糖于50 mL容量瓶，加適量水超聲至溶解），加水定容，搖勻，過0.45 μm水性濾膜，續(xù)濾液供HPLC分析。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Shodex NH2P-50 4E（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水；梯度洗脫（0～15 min，75%～45%乙腈；15～30 min，45%乙腈）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射器檢測溫度：40 ℃，采集頻率：3.125 Hz。以對照品質(zhì)量（μg）的對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積值的對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)方法學(xué)考察，所建方法中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的線性范圍分別為分別0.525～10.508 μg（r=0.999 3）、0.614～12.284 μg（r=0.999 2）、0.636～12.727 μg（r=0.999 4）、0.755～15.102 μg（r=0.999 3），精密度、24 h穩(wěn)定性和加樣回收率等均符合含量測定要求。4種對照品、地麥活性糖及麥冬多糖的色譜圖見圖1～3。

圖1 果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的HPLC 色譜圖

圖2 地麥活性糖的HPLC 色譜圖

圖3 麥冬多糖的HPLC 色譜圖

2.3.3 煮沸滅菌樣品含量 分別精密量取加熱煮沸0、30、60、90、120 min地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見表2。

表2 煮沸滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表2 煮沸滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表2可知，與滅菌前（0 min）比較，隨著煮沸滅菌時(shí)間的增加，地麥活性糖溶液顏色逐漸加深，果糖含量逐漸增加，且煮沸60 min時(shí)，果糖含量明顯增加，蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量變化均小于5.58%，說明果糖含量的增加可能由麥冬多糖分解引起。煮沸90 min時(shí)，果糖含量進(jìn)一步增加，且蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量分別降低9.85%、12.45%和11.74%。結(jié)合“2.2微生物限度檢查”結(jié)果，煮沸滅菌時(shí)間不長于60 min，地麥活性糖中微生物數(shù)量即符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定，地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量也無顯著變化。

2.3.4 100 ℃流通蒸汽滅菌樣品含量 分別精密量取100 ℃流通蒸汽滅菌0、60、120 min地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見表3。

表3 100 ℃流通蒸汽滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表3 100 ℃流通蒸汽滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表3可知，與滅菌前（0 min）比較，100 ℃流通蒸汽滅菌60 min，果糖峰面積對數(shù)增加19.71%，滅菌120 min，果糖含量明顯增加；滅菌后蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量變化均小于5%。說明果糖含量的增加可能由麥冬多糖分解引起。100 ℃流通蒸汽滅菌60 min，微生物限度符合《中華人民共和國藥典》要求，進(jìn)一步考察100 ℃流通蒸汽滅菌30 min對果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量的影響，結(jié)果見表1。

2.3.5 加防腐劑100 ℃流通蒸汽滅菌樣品含量 分別精密量取添加或不添加防腐劑、100 ℃流通蒸汽滅菌30 min前后的地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見表4。

表4 4 種防腐劑對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表4 4 種防腐劑對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表4可知，與滅菌前（0 min）比較，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量均無明顯變化，且防腐劑3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、2‰山梨酸、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯對滅菌前后地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量均無明顯變化，但采用山梨酸為防腐劑在滅菌過程中，包裝容器發(fā)生膨脹。結(jié)合“2.2”項(xiàng)下微生物限度檢查結(jié)果，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min可有效殺滅降低地麥活性糖需氧菌，而不影響4種糖類成分含量，防腐劑可選擇3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯。

2.3.6 120 ℃流通蒸汽滅菌樣品含量 分別精密量取120 ℃流通蒸汽滅菌0、15 min地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見表5。

表5 120 ℃流通蒸汽滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表5 120 ℃流通蒸汽滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表5可知，與滅菌前（0 min）比較，120 ℃流通蒸汽滅菌15 min，地麥活性糖中果糖含量明顯增加，蔗糖和棉子糖含量無明顯變化，水蘇糖含量降低9.29%，說明地麥活性糖中的生地低聚糖和麥冬多糖在120 ℃流通蒸汽條件下均發(fā)生分解，故不能采用120 ℃流通蒸汽滅菌。

2.3.760Co-γ射線輻照滅菌樣品含量 分別精密量取10 kGy60Co-γ射線輻照前后的地麥活性糖溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件分析樣品，計(jì)算果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量，結(jié)果見表6。

表6 60Co-γ 射線輻照滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

表6 60Co-γ 射線輻照滅菌對4 種糖含量的影響（，n=3，mg/mL）

注：/表示低于線性范圍的最低濃度

由表6可知，輻照滅菌前后，地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量無明顯變化，說明10 kGy60Co-γ射線輻照12 h不影響果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量，可用于地麥活性糖滅菌。

3 討 論

近年來，有關(guān)糖類成分治療慢性阻塞性肺疾病[3]、抗急性心肌缺血[4]、抗炎[10]及抗氧化[11]等藥理活性研究越來越多。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)地麥活性糖具有良好的降低高血糖療效。低聚糖、多糖類藥物制備工藝復(fù)雜，在制備、儲(chǔ)存過程中容易污染微生物而變質(zhì)，而滅菌方法對低聚糖、多糖成分影響的研究報(bào)道較少。

目前，常用的物理滅菌方法有干熱滅菌法、濕熱滅菌法、射線滅菌法、微波滅菌法、過濾除菌法和60Co-γ射線輻照等。不同的滅菌方法對多糖含量產(chǎn)生不同程度的影響，如邱曉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度高于60 ℃時(shí)，黨參總多糖可能在高溫下分解，提取液中多糖含量下降。100 ℃流通蒸汽滅菌和煮沸滅菌，不能保證殺滅樣品中所有細(xì)菌的芽孢，除制備過程盡量避免微生物污染，特別是制備成口服液、注射液等液體制劑時(shí)，可添加適宜的抑菌劑，故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察添加或不添加防腐劑，100 ℃流通蒸汽滅菌對糖類成分和微生物的影響；國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》（2015年版）建議中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy[13]，本研究同時(shí)考察10 kGy60Co-γ射線輻照對地麥活性糖中4種糖類成分含量的影響。

多糖或低聚糖在濃硫酸和高溫條件下，會(huì)水解成單糖，并脫水生成糠醛或糠醛衍生物，再與蒽酮或苯酚生成有色化合物，利用該原理，總糖主要通過苯酚-硫酸顯色法和蒽酮-硫酸顯色法法測定含量[14-15]。糖類成分在高溫滅菌過程中可能分解為果糖或葡萄糖等，檢測總糖含量，不足以反映地麥活性糖中生地低聚糖（指標(biāo)成分為果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖）和麥冬多糖的含量變化。張文婷等[16]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector，HPLC-ELSD），以乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測生地黃在炮制過程中寡糖成分的變化，其中蔗糖受熱分解成果糖與葡萄糖，棉子糖受熱分解成蜜二糖、蔗糖和果糖，水蘇糖受熱主要分解成甘露三糖。XU Z等[17]采用超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography,UHPLC）、HPLC、三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和紫外光譜等快速定量分析技術(shù)，研究了3種苷類（梓醇、豆蔻苷和苦杏仁苷）和6種糖（鼠李糖、果糖、蔗糖、蜜二糖、水蘇糖和毛蕊花糖）等含量測定方法。WANG X等[18]采用HILIC-UHPLC-TQ-MS/MS技術(shù)，以甲醇-水（60∶40）為流動(dòng)相，建立了同時(shí)分析地黃中環(huán)烯醚萜苷（秋梨醇、梓醇）和低聚糖（蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露糖和水蘇糖）含量的方法。本研究通過HPLC-ELSD方法，檢測不同滅菌方法對指標(biāo)成分果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量影響，評價(jià)生地低聚糖在不同滅菌過程中的穩(wěn)定性，并通過果糖含量變化間接反映以果糖組成為主的麥冬多糖的穩(wěn)定性。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同滅菌方法對不同批次地麥活性糖中微生物數(shù)量及果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量影響的考察結(jié)果一致，煮沸滅菌30 min、100 ℃流通蒸汽滅菌30 min（防腐劑可選擇3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯）、10 kGy60Co-γ射線輻照12 h均可有效殺滅地麥活性糖中的需氧菌、霉菌和酵母菌，樣品的微生物數(shù)量符合2020年版《中華人民共和國藥典》四部中的微生物限度要求，同時(shí)不影響地麥活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量。

4 結(jié) 論

本研究通過考察煮沸滅菌、100 ℃流通蒸汽滅菌、加防腐劑100 ℃流通蒸汽滅菌、120 ℃流通蒸汽滅菌、10 kGy60Co-γ射線輻照對地麥活性糖指標(biāo)成分果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖含量及微生物數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)煮沸滅菌60 min以上，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min以上，120 ℃流通蒸汽滅菌15 min，雖然能有效殺滅地麥活性糖溶液中的微生物，但地麥活性糖中果糖含量明顯升高、水蘇糖含量明顯降低。防腐劑3‰苯甲酸鈉、0.5‰羥苯乙酯、3‰苯甲酸鈉+0.5‰羥苯乙酯對地麥活性糖中4種糖含量無影響，可為地麥活性糖和其他糖類藥物的滅菌方法提供參考。因缺乏麥冬多糖標(biāo)準(zhǔn)品，本研究主要考察了不同滅菌方法對不同批次地麥活性糖中生地低聚糖指標(biāo)成分的影響，并通過果糖含量變化間接反映以果糖組成為主的麥冬多糖的變化，需要進(jìn)一步研究麥冬多糖的含量測定方法。