劉海云，吳 艷，沈愛(ài)武，王 霞

肝硬化是臨床常見(jiàn)肝臟疾病，病因以病毒性肝炎最為常見(jiàn)，隨著病情進(jìn)展，患者可因門(mén)脈高壓和食管胃底靜脈曲張破裂引發(fā)上消化道出血，并引起嚴(yán)重繼發(fā)感染，而繼發(fā)感染不僅增加了治療成本及難度，還提高了病死率，故尋找與此類(lèi)患者預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)以指導(dǎo)臨床干預(yù)具有重要意義[1]。miRNA是一類(lèi)小型內(nèi)源性非編碼RNA分子，可通過(guò)與信使RNA結(jié)合影響蛋白編碼基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等病理生理過(guò)程[2]。miRNA-122為在肝組織中表達(dá)最豐富的一種miRNA分子。有研究顯示，miRNA-122表達(dá)與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)肝癌診斷及預(yù)后評(píng)估有一定價(jià)值[3]。還有研究報(bào)道，miRNA-122與膿毒癥休克合并肝損傷患者病情及預(yù)后相關(guān)[4]。然而，目前臨床關(guān)于miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者的影響尚不清楚。本研究探討肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素及其血清miRNA-122與預(yù)后關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年6月—2021年3月如皋市人民醫(yī)院收治的肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染80例作為感染組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且經(jīng)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查診斷為上消化道出血；②符合細(xì)菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③年齡>18歲；④接受規(guī)范治療；⑤患者和(或)其家屬簽署相關(guān)知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病和獲得性免疫缺陷綜合征等嚴(yán)重影響預(yù)后疾??；②入院后48 h內(nèi)死亡；③合并真菌感染；④精神障礙；⑤治療依從性差。另選取同期該院收治未合并細(xì)菌感染的肝硬化上消化道出血80例作為非感染組，除細(xì)菌感染診斷外納入及排除標(biāo)準(zhǔn)與感染組一致。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意執(zhí)行。

1.2方法

1.2.1一般資料收集：收集所有入選患者一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、肝硬化病因、肝硬化病程、肝硬化分期、Child肝功能分級(jí)、出血嚴(yán)重程度(出血量<500 ml和≥500 ml分別為輕度和中重度)[7]、腹腔積液、急性生理與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分[8]及入院時(shí)血紅蛋白、血小板、白蛋白水平。

1.2.2血清miRNA-122檢測(cè)：采集所有入選患者入院后第2天清晨空腹肘靜脈血5 ml，于4 ℃下3000 r/min離心15 min，收集上清液，于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)從血清中提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；于無(wú)菌條件下，采用NanoDrop 1000型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Nanodrop公司)檢測(cè)RNA純度，A260/A280值在1.8～2.0視為合格。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(美國(guó)BIO-RAD公司，C1000 Thermal cycler PCR儀)，以?xún)刹椒z測(cè)miRNA-122，先使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)行逆轉(zhuǎn)錄，miRNA-122引物序列：上游引物5'-GACGTCGACTAAGAATGTGAAGGTGAAGTT-3'，下游引物5'-CACGGATCCACAAGATTGAGAAGACTAATA-3'，反應(yīng)條件:37 ℃60 min、95 ℃3 min，獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，采用SYBR premix EX taq試劑盒行樣品上樣；再行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 3 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min；以U6(美國(guó)Invitrogen公司)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt定量分析miRNA-122相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3預(yù)后評(píng)估[8]：根據(jù)住院28 d治療結(jié)果，將肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者分為好轉(zhuǎn)組(57例，治療后臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)好轉(zhuǎn)，或治療后痊愈出院)和惡化組(23例，治療后臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無(wú)好轉(zhuǎn)甚至惡化，或住院期間死亡)兩組。

1.3觀(guān)察指標(biāo) 采用單因素和多因素Logistic回歸分析探討肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素，分析肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級(jí)、APACHEⅡ評(píng)分相關(guān)性，比較好轉(zhuǎn)組和惡化組血清miRNA-122，探討血清miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，感染組肝硬化失代償期、Child肝功能分級(jí)B級(jí)或C級(jí)、中重度出血、有腹腔積液所占比例和APACHEⅡ評(píng)分、血清miRNA-122高于非感染組，入院時(shí)血紅蛋白和白蛋白低于非感染組(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素單因素分析

2.2肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素多因素Logistic回歸分析 以細(xì)菌感染為因變量，單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示肝硬化失代償期、中重度出血、APACHEⅡ評(píng)分≥25分和血清miRNA-122≥2.4是肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，入院時(shí)白蛋白≥22 g/L是肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染的保護(hù)因素(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素多因素Logistic回歸分析

2.3肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級(jí)、APACHEⅡ評(píng)分相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級(jí)、APACHEⅡ評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.391，P=0.002；r=0.286，P=0.021)。

2.4好轉(zhuǎn)組和惡化組血清miRNA-122比較 血清miRNA-122好轉(zhuǎn)組為2.38±0.55低于惡化組3.03±0.49(P<0.01)。

2.5血清miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值 受試者工作特征曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的曲線(xiàn)下面積為0.814(95%CI 0.713,0.914，P<0.001)，最佳截?cái)嘀禐?.85，對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為73.90%和78.90%，見(jiàn)圖1。

圖1 血清miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的受試者工作特征曲線(xiàn)

3 討論

肝硬化患者因肝細(xì)胞受損，蛋白質(zhì)合成能力下降，免疫功能較差，對(duì)細(xì)菌清除及防御能力下降，當(dāng)門(mén)脈高壓引起胃腸淤血后，可損傷腸道黏膜屏障功能，引起腸道菌群移位，增加細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)[9]。有研究顯示，20%～40%的肝硬化上消化道出血患者可伴細(xì)菌感染[10]。夏文恬等[11]報(bào)道，肝硬化上消化道出血并發(fā)細(xì)菌感染主要影響因素為肝硬化失代償期、出血嚴(yán)重程度及住院時(shí)間；崔宏等[12]研究顯示，肝硬化合并腹腔感染以革蘭陰性菌為主，且對(duì)第三和四代頭孢菌素耐藥率較高。然而，現(xiàn)臨床上關(guān)于肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后評(píng)估的研究并不多見(jiàn)。本研究分析肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染影響因素及其血清miRNA-122與預(yù)后關(guān)系，以期為此類(lèi)患者預(yù)后評(píng)估及感染防控提供新的思路。

miRNA與多種疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，且血清miRNA不易被RNA酶降解，故血清miRNA成為多種疾病熱門(mén)生物學(xué)標(biāo)志物[13]。miRNA-122位于染色體17q23.2的FRA17B脆性區(qū)域，有自主調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用。有研究報(bào)道，miRNA-122可與陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CAT-1)信使RNA結(jié)合，并通過(guò)抑制CAT-1合成來(lái)介導(dǎo)機(jī)體蛋白質(zhì)合成障礙[14]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-122能與抗凋亡基因家族Bcl-2和Bcl-xL的信使RNA結(jié)合并抑制抗凋亡基因表達(dá)，進(jìn)而加速細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，感染組血清miRNA-122高于非感染組，提示血清miRNA-122可能與肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染有關(guān)。有研究報(bào)道，膿毒癥患者血清miRNA-122升高，其一方面通過(guò)抑制CAT-1合成加重機(jī)體蛋白質(zhì)合成障礙;另一方面通過(guò)抑制抗凋亡基因表達(dá)來(lái)介導(dǎo)大量淋巴細(xì)胞凋亡，使機(jī)體獲得性免疫功能降低，從而引起難以控制的繼發(fā)性感染[16]。本研究多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miRNA-122≥2.4是肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清miRNA-122與肝硬化上消化道出血患者細(xì)菌感染相關(guān)。其機(jī)制可能與miRNA-122影響機(jī)體蛋白質(zhì)合成和促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Child肝功能分級(jí)越高說(shuō)明患者肝損傷越嚴(yán)重[17]。本研究結(jié)果顯示，肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級(jí)呈正相關(guān)，提示血清miRNA-122與肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者肝損傷有關(guān)。有研究報(bào)道，血清miRNA-122升高與膿毒癥肝損傷有關(guān)[18]；還有文獻(xiàn)顯示，慢性丙型肝炎患者血清miRNA-122升高，升高程度與肝組織炎癥壞死程度有關(guān)[19]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。APACHEⅡ評(píng)分在重癥醫(yī)學(xué)科患者病情及預(yù)后評(píng)估中有重要作用，分值越高，病情越重，死亡風(fēng)險(xiǎn)越高[20]。本研究結(jié)果顯示，肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者血清miRNA-122與APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)，提示血清miRNA-122可能與肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，血清miRNA-122好轉(zhuǎn)組低于惡化組，提示血清miRNA-122可能參與肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者病情進(jìn)展。此外，本研究受試者工作特征曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的曲線(xiàn)下面積為0.814，最佳截?cái)嘀禐?.85，提示血清miRNA-122對(duì)肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染患者預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。然而，本研究為單中心研究且樣本量有限，研究結(jié)果有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

總之，血清miRNA-122是肝硬化上消化道出血合并細(xì)菌感染的影響因素，與其肝功能、病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，對(duì)其預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。