孫 劍，高 楊，康榮基，黃 毅,陸 林

目前,結直腸癌發(fā)病率逐年上升[1]，且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。結直腸癌總生存率近10年沒有明顯升高趨勢，尤其是晚期結直腸癌患者[3]?，F(xiàn)結直腸癌發(fā)病機制的研究及治療方式的探討仍是熱點內(nèi)容[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種惡性腫瘤中具有調控作用，或許可作為惡性腫瘤預測、早期診斷及預后分析的標志物，或者將來可作為惡性腫瘤治療的靶基因。長鏈非編碼RNA00261(LINC00261)是一種lncRNA，在多種惡性腫瘤中作為抑癌基因對腫瘤生物學行為進行調控。LINC00261在胰腺癌、肝癌、肺癌和乳腺癌中介導細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等，并與腫瘤的惡性臨床病理特征具有相關性[5-6]，但以往其在結直腸癌中的研究并不深入。本研究首先采用生物信息學技術對LINC00261在結直腸癌中的研究結果進行了萃取，預測了其下游靶標miRNA，并在組織和細胞水平進行了進一步驗證，以期為深入研究LINC00261在結直腸癌中的作用及機制提供前期研究基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月—2020年5月遼陽市中心醫(yī)院收治的行手術治療的結直腸癌30例，男17例，女13例；年齡41～82(68.9±17.2)歲。30例均手術切除結直腸癌組織和距離癌組織邊緣5 cm的正常結直腸組織標本各0.5 cm3置于液氮罐中保存。30例臨床和病理資料均通過查閱病歷進行收集，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、血管神經(jīng)浸潤、TNM分期及分化程度。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析：應用Linked Omics (http://www.linkedomics.org)進行癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)采集分析，對LINC00261在結直腸癌組織和正常組織水平的數(shù)據(jù)進行采集，并篩選與其相關聯(lián)的miRNA。采用靶基因預測分析軟件對LINC00261和miR-31的靶向調控進行結合位點預測。

1.2.2細胞培養(yǎng)：SW480、HCT116、HT-29及FHC細胞(購自中國科學院上海典型細胞庫)采用貼壁細胞培養(yǎng)法，在錦州醫(yī)科大學科學試驗中心進行培養(yǎng)及傳代，采用90% MEM培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司)，10%胎牛血清。培養(yǎng)條件：37 ℃，5%二氧化碳。細胞培養(yǎng)隔天換液，觀察細胞生長狀態(tài)，每組細胞至少經(jīng)3次傳代后取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3qRT-PCR:采用qRT-PCR檢測組織及細胞中LINC00261和miR-31表達。所用試劑盒包括Trizol試劑盒(購自美國Sigma公司)和逆轉錄試劑盒(購自日本TaKaRa公司)。取組織標本(結直腸癌組織及正常結直腸組織)3 mm3，在冰上剪碎，并研磨，采用Trizol試劑盒進行裂解和總RNA提取。對于細胞標本(SW480、HCT116、HT-29及FHC細胞)，取對數(shù)生長期細胞按照Trizol試劑盒說明書進行裂解及總RNA提取，采用紫外吸收法檢測RNA質量，包括RNA液濃度、純度和完整性。RNA逆轉錄為cDNA，反應體系如下：5 μl DEPC水、0.2 μl逆轉錄Buffer、0.5 μl逆轉錄酶MMLV、0.2 μl下游引物、0.2 μl上游引物、0.1 μl dNTP、2 μl RNA模板。管家基因為GAPDH，對標準品進行梯度稀釋，進行qRT-PCR，反應條件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，共40個循環(huán)。制備DNA模板用于繪制梯度稀釋標準曲線,反應體系包括3 μl dNTP混合液、1 μl cDNA、1.5 μl MgCl2溶液、2.5 μl PCR緩沖液、1 μl Taq聚合酶、0.5 μl上游引物F、0.5 μl下游引物R。進行35個PCR循環(huán)。將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應，繪制溶解曲線。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt。

1.3觀察指標 應用生物信息學分析LINC00261在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達及相關miRNA，采用qRT-PCR檢測LINC00261和miR-31在結直腸癌和正常結直腸組織及細胞中表達，分析結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性，探討結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達的相關性。

2 結果

2.1生物信息學分析LINC00261在結直腸癌和正常結直腸組織中表達及相關miRNA 生物信息學分析結果顯示，LINC00261在結直腸癌組織中表達低于正常結直腸組織，見圖1a；結直腸癌組織中與LINC00261具有負相關性的miRNA見圖1b；靶基因預測分析軟件預測LINC00261與miR-31具有結合位點，可能具有靶向調控關系，見圖1c。

圖1 生物信息學分析LINC00261在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達及相關miRNALINC00261為長鏈非編碼RNA00261；1a.LINC00261在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達；1b.結直腸癌組織中與LINC00261相關的miRNA；1c.LINC00261與miR-31相結合的預測靶點

2.2qRT-PCR檢測LINC00261和miR-31在結直腸癌和正常結直腸組織及細胞中表達 qRT-PCR檢測結果顯示，LINC00261在結直腸癌組織中為1.116±0.586低于正常結直腸組織2.077±1.153；miR-31在結直腸癌組織中為2.239±1.145高于正常結直腸組織1.251±0.759(P<0.05)。LINC00261在結直腸癌細胞株中分別為0.247±0.060、0.443±0.170和0.393±0.248，低于正常結直腸上皮細胞1.249±0.286；miR-31在結直腸癌細胞株中分別為1.118±0.172、0.756±0.206和1.535±0.134，高于正常結直腸上皮細胞0.331±0.172(P<0.05)。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測LINC00261和miR-31在結直腸癌和正常結直腸組織及細胞中的表達LINC00261為長鏈非編碼RNA00261；2a.LINC00261在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達；2b.miR-31在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達；2c.LINC00261在結直腸癌細胞株和正常結直腸上皮細胞中的表達，與FHC比較，aP<0.05；2d.miR-31在結直腸癌細胞株和正常結直腸上皮細胞中的表達，與FHC比較，aP<0.05

2.3結直腸癌組織中LINC00261和miR-31表達與結直腸癌患者臨床病理特征相關性 結直腸癌組織中LINC00261表達腫瘤直徑>5 cm、血管神經(jīng)浸潤陽性、TNM分期Ⅲ或Ⅳ期和低分化程度結直腸癌患者低于腫瘤直徑≤5 cm、血管神經(jīng)浸潤陰性、TNM分期Ⅰ或Ⅱ期和高中分化程度結直腸癌患者(P<0.05或P<0.01)。結直腸癌組織中miR-31表達腫瘤直徑>5 cm和TNM分期Ⅲ或Ⅳ期結直腸癌患者高于腫瘤直徑≤5 cm和TNM分期Ⅰ或Ⅱ期結直腸癌患者(P<0.05)。見表1。

表1 結直腸癌組織中LINC00261和miR-31表達與結直腸癌患者臨床病理特征相關性

2.4結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達呈負相關(r=-0.715，P<0.001，95%CI:-0.855，-0.478)，見圖3。

圖3 結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達Pearson相關性分析LINC00261為長鏈非編碼RNA00261

3 討論

非編碼RNA調控大部分人類基因的轉錄過程，在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有明顯調控作用[7]。lncRNA長度長于200個核苷酸，具有一定蛋白編碼能力[8]。LINC00261在胰腺癌、前列腺癌及肺癌等組織中表達水平低于對應正常組織，并與藥物治療效果具有較強相關性[9]。以往文獻有關結直腸癌組織LINC00261表達的研究極少。有研究報道，在不同腫瘤中，與LINC00261具有靶向調控關系的miRNA包括miR-324、miR-769、miR-124、miR-216b、miR-133a及miR-4735等[10]，但在結直腸癌中現(xiàn)尚缺乏該類研究數(shù)據(jù)。

本研究首先通過生物信息學分析對組織水平LINC00261的研究結果進行了萃取，結果顯示LINC00261在結直腸癌組織中表達低于正常結直腸組織；進一步通過生物信息學分析收集了與LINC00261具有負相關性的miRNA，并通過靶基因預測分析軟件預測發(fā)現(xiàn)LINC00261與miR-31具有結合位點，可能具有靶向調控關系。由于以往此類通過生物信息學分析的數(shù)據(jù)均來源于西方國家，樣本量也較小，故本研究以結直腸癌手術切除的病理標本對其進行驗證。本研究qRT-PCR檢測結果顯示，LINC00261在結直腸癌組織中表達低于正常結直腸組織，miR-31在結直腸癌組織中表達高于正常結直腸組織；LINC00261在結直腸癌細胞株中表達低于正常結直腸上皮細胞，miR-31在結直腸癌細胞株中表達高于正常結直腸上皮細胞。表明LINC00261在結直腸癌組織中的表達水平與生物信息學分析結果一致；miR-31在結直腸癌組織及細胞中表達上調，可能作為促癌基因發(fā)揮作用。miRNA作為非編碼RNA在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要生物學調控功能。有研究顯示，lncRNA以海綿方式作用于miRNA[11-12]。本研究預測LINC00261與miR-31具有結合位點，但其調控關系需進一步實驗證明。本研究結果顯示，結直腸癌組織中LINC00261表達腫瘤直徑>5 cm、血管神經(jīng)浸潤陽性、TNM分期Ⅲ或Ⅳ期和低分化程度結直腸癌患者低于腫瘤直徑≤5 cm、血管神經(jīng)浸潤陰性、TNM分期Ⅰ或Ⅱ期和高中分化程度結直腸癌患者；miR-31表達腫瘤直徑>5 cm和TNM分期Ⅲ或Ⅳ期結直腸癌患者高于腫瘤直徑≤5 cm和TNM分期Ⅰ或Ⅱ期結直腸癌患者。表明LINC00261和miR-31與結直腸癌患者腫瘤直徑和TNM分期等臨床病理特征具有相關性。有研究顯示，LINC00261在胃癌組織中表達下調，其低表達與胃癌患者臨床病理特征具有相關性[13]。LINC00261在肺癌組織中也表現(xiàn)出同樣的抑癌基因特征[12]。本研究結果與上述文獻報道結果基本一致。本研究通過Pearson相關性分析對結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達的相關性進行了探討，結果顯示結直腸癌組織LINC00261和miR-31表達呈負相關。因此，今后可行進一步研究對LINC00261與miR-31可能存在的靶向調控關系進行探討。

總之，本研究通過生物信息學分析對LINC00261在結直腸癌組織中表達水平進行了觀察，并進一步驗證了LINC00261在結直腸癌組織及細胞中的表達水平，預測了其與miR-31的調控靶點，為進一步論證LINC00261通過miR-31調控結直腸癌細胞的作用及機制提供了前期實驗基礎，并為LINC00261作為結直腸癌診斷標志物、預后評價指標和未來治療靶點的研究提供了新的靶標基因。