劉 敏，邱現(xiàn)良，陳 秋

（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都 610075）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一組以持續(xù)高血糖為特征的慢性代謝性疾病，可導(dǎo)致腎臟、眼底、心血管及神經(jīng)等多個器官和組織的慢性損害及功能障礙。國際糖尿病聯(lián)盟公布的數(shù)據(jù)顯示，糖尿病已成為繼心血管疾病和癌癥之后威脅人類健康的第三大殺手［1］。據(jù)WHO 最新統(tǒng)計，2012 年DM直接造成150 萬人死亡，2014 年全球約有4.22 億（每11 人中就有1 人）糖尿病患者，是1980 年的14 倍，預(yù)計到2030 年糖尿病患者將達(dá)到6 億［2］?？固悄虿∷幬锶珉p胍類、磺酰脲類等在臨床被廣泛應(yīng)用，但由于“一個靶點，一種藥物”的作用機(jī)制，它們可能具有相似的副作用，如體重增加、心血管疾病、低血糖和胃腸道反應(yīng)等［3］。與合成藥物相比，中藥具有多成分、多靶點聯(lián)合或協(xié)同作用的特點，在DM 治療中發(fā)揮了重要作用［4］。

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，整合網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和藥理學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認(rèn)為是一種有前景的更具成本效益的藥物開發(fā)方法［5］。與傳統(tǒng)的“一基因、一藥、一病”模式相比，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重對疾病的“多靶點、多成分”治療。它可以揭示多組分和多靶標(biāo)之間潛在的復(fù)雜關(guān)系，并提供了系統(tǒng)水平的方法來理解疾病的發(fā)病機(jī)制［6］，而通過高通量篩選和生物信息學(xué)技術(shù)，還可建立可行的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型［7］，其研究方法的整體性、系統(tǒng)性特點與中醫(yī)理論中的整體觀和辨證原則不謀而合。據(jù)報道網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有多種應(yīng)用，如中藥成分靶標(biāo)/疾病基因預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)平衡調(diào)控、協(xié)同成分對和活性成分組的解析［8-10］。因此，包括網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)在內(nèi)的基于網(wǎng)絡(luò)的方法得到了越來越多的發(fā)展和應(yīng)用。

本研究主要基于數(shù)據(jù)挖掘分析國醫(yī)大師張發(fā)榮教授的用藥經(jīng)驗，張老在臨證治療2 型糖尿病時常于辨治方中加用中藥鬼箭羽，每每取得良好的臨床療效。鬼箭羽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其干有直羽如持箭予自衛(wèi)之狀，故又名衛(wèi)矛。鬼箭羽味苦，性寒，入足厥陰經(jīng)，具破血通經(jīng)、散瘀止痛、解毒殺蟲之功，主治經(jīng)閉、癥瘕、產(chǎn)后瘀滯腹痛、蟲積腹痛等癥［11］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有降血糖、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫等作用，近年來臨床多用于治療糖尿病、高脂血癥、動脈硬化及腎臟疾病等［12-15］，效果顯著。因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對鬼箭羽活性成分及作用靶點進(jìn)行篩選，研究其多成分-多靶點-多通路作用模式，以探索鬼箭羽治療2 型糖尿病的潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 鬼箭羽主要活性成分及靶點預(yù)測

通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）獲得鬼箭羽主要活性成分，根據(jù)外源化學(xué)物在人體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的動態(tài)變化規(guī)律，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 及小腸上皮細(xì)胞滲透率（Caco-2）≥-0.04 為篩選閾值。同時在TCMSP 數(shù)據(jù)庫提取鬼箭羽所有活性成分的潛在靶點數(shù)據(jù)，應(yīng)用Perl（version 5.28.1）篩選出鬼箭羽主要活性成分的對應(yīng)靶點，為方便后續(xù)分析，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫在靶點全稱后注釋其基因名（Gene Symbol）。

1.2 “藥物-疾病”共同作用靶點預(yù)測

以“Diabetes Mellitus，Type 2”為關(guān)鍵詞分別檢索人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM），建立與2 型糖尿病相關(guān)的靶點數(shù)據(jù)集。運(yùn)用R（version 3.6.3）軟件中“VennDiagram”包，對鬼箭羽主要活性成分對應(yīng)的靶點和2 型糖尿病的靶點數(shù)據(jù)集進(jìn)行匹配重合，整合得到藥物和疾病的共同作用靶點進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

應(yīng)用Perl project 將獲取的鬼箭羽主要活性成分的作用靶點和“藥物-疾病”的共同作用靶點進(jìn)行相互映射，可獲得網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的屬性（type.txt），節(jié)點之間的連線關(guān)系（network.txt）以及藥物活性成分列表（molLists.txt）。將以上文件輸入Cytoscape（version 3.7.2），以 構(gòu) 建“藥 物-成 分-靶 點-疾病”關(guān)系的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點的屬性包括藥物、活性成分、共同作用靶點和疾病，若經(jīng)預(yù)測成分與靶點之間存在對應(yīng)關(guān)系，則在網(wǎng)絡(luò)中以邊連接。

1.4 “藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將鬼箭羽和T2DM 的靶點基因交集上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（version 11.0），限定物種為人（Homo sapiens），設(shè)置最低要求的相互作用評分為highest confidence（0.900），隱去離散的節(jié)點，以獲得鬼箭羽治療T2DM 的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（Protein-Protein Interaction，PPI），并 導(dǎo) 出string-interaction.tsv，基于PPI 網(wǎng)絡(luò)中每個基因連接節(jié)點的數(shù)目（count 值）篩選出鬼箭羽治療T2DM 的關(guān)鍵靶點。

1.5 GO 富集分析及KEGG 信號通路分析

應(yīng)用R 中“org.Hs.eg.db（version 3.10.0）”包，將鬼箭羽與T2DM 共同作用靶點的基因Symbol 轉(zhuǎn)換為基因ID，再安裝“Bioconductor（version 3.10）”包對其進(jìn)行GO（Gene Ontology）生物學(xué)過程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路分析，顯著性閾值設(shè)為P＜0.05，得到鬼箭羽治療T2DM 靶點的主要生物過程和信號通路。GO 富集分析的結(jié)果將以柱狀圖和氣泡圖的形式展示，并提供KEGG 通路富集分析的柱狀圖及信號通路圖結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 藥物-疾病交集靶點預(yù)測結(jié)果

根據(jù)方法部分所述，以“鬼箭羽”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)文獻(xiàn)及TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共獲得8 種滿足篩選條件的鬼箭羽活性成分和284 個作用靶點，其中作用靶點數(shù)目較多的活性成分為槲皮素（154 個）、山奈酚（63 個）和β-谷甾醇（38 個），見表1。以“Diabetes Mellitus，Type 2”分別檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫，共獲得與T2DM 相關(guān)的疾病靶點信息11 750 個，將上述鬼箭羽主要活性成分的作用靶點與T2DM 的疾病靶點數(shù)據(jù)庫取交集，最終得到154 個共同作用靶點。

表1 鬼箭羽主要活性成分?jǐn)?shù)據(jù)信息Tab 1 Data information of main active ingredients of Euonymus alatus

2.2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

基于方法部分所述，通過Cytoscape 軟件對“藥物-成分-靶點-疾病”關(guān)系進(jìn)行可視化，可直觀得出鬼箭羽主要成分、T2DM 和作用靶點之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。其中紅色和藍(lán)色多邊形分別代表疾病和藥物名稱，紫色三角形代表鬼箭羽的主要活性成分，綠色圓形代表鬼箭羽和T2DM 的共同作用靶點，連線代表藥物、藥物活性成分、疾病及作用靶點之間的相互關(guān)系，見圖1。結(jié)果顯示，鬼箭羽的同一活性成分可調(diào)控多個靶點，同一靶點與多個活性成分相作用，充分體現(xiàn)了鬼箭羽在治療T2DM 多成分、多靶點的作用特點。

圖1 鬼箭羽的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Drug-ingredient-target-disease network of Euonymus alatus

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將鬼箭羽主要活性成分和T2DM 的交集靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），見圖2。經(jīng)計算，PPI 網(wǎng)絡(luò)中有154 個作用節(jié)點，490 條相互作用連線，圖中每個節(jié)點（Nodes）代表由單個蛋白編碼基因位點產(chǎn)生的多個蛋白，節(jié)點之間的連線（Edges）代表蛋白互作關(guān)系，連線的不同顏色則表示不同的互作證據(jù)。圖3為基于count 值選取排名Top30 的蛋白質(zhì)節(jié)點，主要包括Jun 原癌基因（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1、MAPK8）、絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋 白 激 酶（AKT1）、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、白細(xì)胞介素（IL6、CXCL8）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）等。蛋白連接節(jié)點的數(shù)目越多代表其在整個PPI 網(wǎng)絡(luò)中互作關(guān)系越頻繁，提示該蛋白可能是鬼箭羽治療T2DM 的核心調(diào)控靶點。

圖2 “鬼箭羽-疾病”靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Target interaction network of“Euonymus alatus-disease”

圖3 鬼箭羽治療T2DM 的核心調(diào)控靶點Fig 3 Key regulatory targets of Euonymus alatus in treating T2DM

2.4 GO 富集分析

對藥物-疾病的共同作用靶點進(jìn)行GO 功能富集分析，共富集到153 條生物過程（P＜0.05）。根據(jù)差異基因在GO term 富集的顯著性程度（P值），篩選得到前20 條主要生物過程，如圖4，其中顏色越紅表示富集的顯著性越高（P值越小）。這些生物過程主要包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、血紅素結(jié)合等。圖5 所示氣泡圖可顯示富集基因數(shù)占上傳基因總數(shù)的比例（Gene Ratio），圓點越大表示占比越大，P值越小則顏色越紅，其中比例較大的為DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性。表明鬼箭羽治療T2DM 可能是通過參與以上的生物學(xué)調(diào)控過程發(fā)揮作用。

圖4 潛在靶點生物學(xué)過程的GO 分析Fig 4 GO analysis of potential targets in biological processes

圖5 GO 生物功能富集分析的氣泡圖Fig 5 Bubble plot for GO biofunctional enrichment analysis

2.5 KEGG 信號通路富集分析

通過R 中“clusterProfiler”包對藥物-疾病交集靶點進(jìn)行通路富集分析，共富集到156 條顯著通路（P＜0.05），將P值由小到大排列篩選出前20 條主要信號通路，如圖6。通路主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、膀胱癌、TNF 信號通路、胰腺癌、IL-17 信號通路、丙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染、肺癌、HIF-1 信號通路、甲型流感病毒、內(nèi)分泌抵抗等，并與PI3K-Akt 信號通路、NF-κB 信號通路、胰島素抵抗、AMPK 信號通路、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、胰島素信號通路、脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)等有相關(guān)性，表明鬼箭羽活性成分可作用于不同的信號通路綜合發(fā)揮治療T2DM 的作用。圖7 標(biāo)注了鬼箭羽主要活性成分在AGE-RAGE 信號通路中的作用靶點。

圖6 潛在靶點的KEGG 信號通路富集分析Fig 6 KEGG signaling pathway enrichment analysis of potential targets

圖7 鬼箭羽在AGE-RAGE 信號通路中的作用靶點Fig 7 Targets of Euonymus alatus in AGE-RAGE signaling pathway

3 討論

糖尿病可歸屬于中醫(yī)“消渴”或“消癉”范疇。《靈樞·五變》曰“怒則氣上逆，胸中蓄積，血氣逆留，髖皮充肌，血脈不行，轉(zhuǎn)而為熱，熱則消肌膚，故為消癉”，明確指出了消渴與瘀血之間的關(guān)系?！侗静輦湟份d鬼箭羽“苦寒，破陳血，通經(jīng)”，清楊時泰在《本草述鉤元》中謂本品“大抵其功精專于血分”。國醫(yī)大師張發(fā)榮教授認(rèn)為消渴病“陰虛為本，燥熱為標(biāo)，瘀血為患”，而鬼箭羽味苦善于堅陰，性寒能入血，又長于清解陰分之燥熱，對消渴病之陰虛燥熱者，每于辨治方中配伍本品15～30 g，能清熱止渴，降低血糖和尿糖，屢獲良效。且鬼箭羽具破血散瘀之功，對糖尿病并發(fā)心腦血管和腎臟、視網(wǎng)膜及神經(jīng)系統(tǒng)等病變，可改善血液循環(huán)，促進(jìn)新陳代謝，正所謂“通經(jīng)隧、行瘀血、布津氣”，亦可使方中補(bǔ)益藥活潑暢榮而不壅膩，實為治療消渴病之上選藥品。

本研究中發(fā)現(xiàn)鬼箭羽作用于T2DM 的主要活性成分有8 個，其中作用靶點數(shù)目較多的成分為槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇。在對糖尿病大鼠的試驗中顯示，研究劑量的槲皮素可顯著逆轉(zhuǎn)高血糖，降低糖化血紅蛋白和肝糖原水平，改善胰腺抗氧化狀態(tài)，還能預(yù)防和治療慢性高血糖時血紅蛋白糖基化相關(guān)的繼發(fā)性并發(fā)癥［16］，槲皮素還可通過減少iNOS 表達(dá)、降低NO 水平及NF-κB 易位抑制等起到保護(hù) 胰 島β 細(xì) 胞 的 作 用［17-19］。山 奈 酚 可 激 活cAMP/PKA 通路介導(dǎo)產(chǎn)生促胰島素分泌作用，還可上調(diào)Akt、Bcl-2 蛋 白 的 表 達(dá) 和 降 低caspase-3 活 性，保 護(hù)胰島β 細(xì)胞不受高血糖誘導(dǎo)的凋亡和功能障礙的影響［20］。β-谷甾醇可增強(qiáng)糖酵解活性，刺激殘余β 細(xì)胞的胰島素分泌，增加糖尿病大鼠的肝葡萄糖利用，從而發(fā)揮降血糖作用［21］。此外，基于PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得出鬼箭羽主要活性成分有JUN、MAPK1、AKT1、RELA、IL6、MAPK8、EGFR、ESR1、FOS、CXCL8 等多個作用靶點，表明鬼箭羽治療T2DM具有多成分、多靶點的特點。

GO 富集分析得到153 條生物過程，其中富集結(jié)果最顯著的是核受體活性（nuclear receptor activity）。核受體在包括發(fā)育和代謝穩(wěn)態(tài)在內(nèi)的關(guān)鍵過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，也被稱為代謝性核受體。PPARs（亞 型α、β 和γ）是Ⅱ型 核 受 體，在 脂 質(zhì) 代謝［22］和脂肪細(xì)胞分化［23］以及胰島素反應(yīng)［24］中發(fā)揮重要作用，其中PPARα 活化可導(dǎo)致肝臟和肌肉中脂肪酸氧化增加［25，26］，而PPARγ 活化主要在脂肪組織中增加胰島素敏感性［27］，這兩種途徑使PPARs 在血脂異常和糖尿病的治療中成為重要靶點。研究最多的PPARs 合成配體是噻唑烷二酮類藥物（TZD），這類藥物甚至在了解其作用機(jī)制之前就用于增加胰島素敏感性，研究發(fā)現(xiàn)TZD 可通過活化PPARγ 降低胰島素抵抗、改變脂肪細(xì)胞分化并誘導(dǎo)脂蛋白脂酶（LPL）合成［28-30］，十多年來被有效地用于2 型糖尿病的治療。貝特類藥物通過肝臟中PPARα 介 導(dǎo) 的LPL 活 化 增 加 甘 油 三 酯 脂 解［31］，PPARα 的活化還可通過參與脂蛋白代謝中靶基因的轉(zhuǎn)錄變化增加高密度脂蛋白（HDL）水平［32］，這些作用共同改善了致動脈粥樣硬化脂蛋白平衡，降低了心血管疾病的發(fā)病率。

KEGG 信號通路分析中富集結(jié)果最顯著的是AGE-RAGE 信號通路。研究表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）與其受體（RAGE）結(jié)合后可啟動一系列受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從多個途徑參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［33］。腎臟在持續(xù)高血糖環(huán) 境 中 產(chǎn) 生 大 量AGEs 上 調(diào)RAGE 表 達(dá)，RAGE 的過表達(dá)可導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生并使炎癥加劇，從而促進(jìn)腎臟慢性炎癥狀態(tài)的建立，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能逐漸喪失［34］。Burke 等［35］對猝死于心血管并發(fā)癥的糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，其冠狀動脈斑塊中RAGE 和EN-RAGE 的表達(dá)明顯高于非糖尿病患者，RAGE/EN-RAGE 的表達(dá)可能進(jìn)一步損害細(xì)胞存活并促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定。AGEs-RAGE 相互作用還可引起外周神經(jīng)中致炎基因的轉(zhuǎn)錄和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，激活NF-κB，進(jìn)而促使糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生［36］，更有研究顯示，在糖耐量減低階段AGE/RAGE/NF-κB 即已活化［37］。因此，AGE-RAGE 通路可能是鬼箭羽治療2 型糖尿病及預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥的重要機(jī)制之一。其次根據(jù)KEGG 富集分析結(jié)果，推測鬼箭羽還具有良好的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用，可進(jìn)一步拓展其臨床應(yīng)用及相關(guān)分子機(jī)制研究。

綜上所述，本研究首次應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對鬼箭羽治療T2DM 的潛在分子機(jī)制進(jìn)行了探索，篩選出鬼箭羽8 種主要活性成分及154 個藥物-疾病共同作用靶點，并構(gòu)建了“藥物-成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖，通過富集分析，發(fā)現(xiàn)了153 個生物過程和156 條信號通路直接或間接參與治療T2DM 及相關(guān)并發(fā)癥，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的特點。本研究的局限性在于，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大量數(shù)據(jù)庫所做的預(yù)測，數(shù)據(jù)搜集的全面性及活性成分篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異會對研究結(jié)果有一定影響，因此后續(xù)還需進(jìn)一步過濾藥物活性成分，開展體內(nèi)或體外實驗，并完善中藥復(fù)方成分的質(zhì)量評價，為鬼箭羽的臨床應(yīng)用提供科學(xué)實用的證據(jù)支持，本研究可為后續(xù)相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。