劉明嶺，何家穎，陳靖雯，鄧日輝，徐 強，林昌松

（廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

痛風是一種表現(xiàn)為發(fā)作性關節(jié)紅腫熱痛的炎性疾病。腸道菌群與痛風有密切關系。GUO Z等[1]通過腸道菌群測序技術分析，發(fā)現(xiàn)痛風患者的腸道菌群整體結構與健康人群具有顯著的差異，痛風患者腸道菌群中糞便擬桿菌（Bacteroides caccae）和木糖降解擬桿菌（Bacteroides xylanisolvens）致病菌豐度升高，而另2種益生菌普氏糞桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）和假小鏈雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）豐度降低。腸道菌群失調(diào)可導致尿酸晶體誘導產(chǎn)生NLRP3炎癥小體相關的酶激活，最終導致痛風急性發(fā)作[2]。腸道菌群參與了嘌呤代謝酶的合成及炎癥因子的釋放[3]。ZAKHARZHE VSKAYA N B等[4]在動物模型中注射尿酸鹽結晶后觀察到了關節(jié)炎癥的發(fā)生，而在無菌小鼠模型中注射尿酸鹽結晶卻未見關節(jié)炎癥反應。腸道菌群在尿酸代謝、關節(jié)炎癥反應中均具有關鍵作用。

目前中醫(yī)研究認為，痛風急性發(fā)作最常見的病因病機是濕濁瘀熱痹阻關節(jié)[5]?！吨嗅t(yī)內(nèi)科病證診斷療效標準》有關痛風的證候分為4個證型，即濕熱蘊結、瘀熱阻滯、痰濁阻滯、肝腎陰虛[6]。本研究根據(jù)臨床痛風急性發(fā)作的常見證候，選擇濕熱蘊結與瘀熱阻滯進行探討。目前尚未見相關研究報道這2種證型客觀的物質(zhì)基礎及其與腸道菌群的相關性。本研究采用宏基因組學技術研究腸道菌群與痛風急性發(fā)作的中醫(yī)證型的相關性，旨在揭示痛風急性發(fā)作的關鍵菌群及不同中醫(yī)證型的差異菌群，旨在為研究痛風急性發(fā)作的機制、中醫(yī)證型的物質(zhì)基礎提供參考。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷 痛風急性發(fā)作診斷參照2015年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯(lián)盟痛風分類標準[7]，符合痛風診斷，符合1977年美國風濕病協(xié)會分類標準急性痛風關節(jié)炎的分類標準[8]。

1.1.2 中醫(yī)診斷 濕熱蘊結證與瘀熱阻滯證辨證參照《中醫(yī)內(nèi)科病證診斷療效標準》中痛風的診斷依據(jù)、證候分類、療效評定[6]。（1）濕熱蘊結證：下肢小關節(jié)卒然紅腫熱痛、拒按，觸之局部灼熱，得涼則舒，伴發(fā)熱口渴，心煩不安，溲黃。舌紅，苔黃膩，脈滑數(shù)。（2）瘀熱阻滯證：關節(jié)紅腫刺痛，局部腫脹變形，屈伸不利，肌膚色紫暗，按之稍硬，病灶周圍或有塊瘰硬結，肌膚干燥，皮色暗黧。舌質(zhì)紫暗或有瘀斑，苔薄黃，脈細澀或沉弦。

1.2 納入標準（1）符合痛風急性發(fā)作期診斷標準及中醫(yī)證候標準；（2）年齡18～65歲，性別不限；（3）本次就診為急性起病，病程在48 h內(nèi)；（4）患者自愿接受并配合檢查。

1.3 排除標準（1）近3個月內(nèi)使用過抗生素、益生菌等；（2）合并急性感染及有嚴重心腦血管疾病及嚴重肝腎功能損害；（3）有精神疾患或依從性差的患者；（4）妊娠或哺乳期婦女。

1.4 研究對象 本研究選擇2019年3月至2020年12月在本院風濕病科住院治療的痛風急性發(fā)作期患者40例，濕熱蘊結組與瘀熱阻滯組各20例。同時納入治未病中心健康體檢人群20人為健康對照組。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理學委員會批準（NO.K[2019]096）。

1.5 觀察指標

1.5.1 臨床信息 參考《中醫(yī)病證診斷療效標準》[9]及《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[10]設計病例信息記錄表，收集研究對象年齡、性別、體質(zhì)量、身高、既往病史、痛風病史、癥狀、體征、中醫(yī)舌脈及相關檢驗指標等信息。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）=體質(zhì)量（kg）/身高（m）2。

1.5.2 樣本采集與儲存 收集受試者新鮮自然排出的糞便約2 g，置于2 mL無菌凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。4 ℃冷藏條件下送至武漢華大醫(yī)學檢驗所有限公司進行測序和分析。

1.5.3 提取糞便DNA 采用MagPure Stool DNAKF kit B（Magen，中國）提取糞便中微生物群落DNA。質(zhì)控采用BR Assay kit（Invitrogen，美國）對DNA進行熒光定量檢測。

1.5.4 DNA擴增與測序 采用16sRNA基因的V4區(qū)對基因組進行擴增，PCR引物上下游分別為，515F（5'-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3'）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。前后端均采用Illumina接合器、pad和連接子序列標記引物。PCR擴增前，模板濃度統(tǒng)一稀釋到0.6 ng/μL。PCR循環(huán)條件結果如下：95 ℃3 min，95 ℃30個循環(huán)45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，72 ℃持續(xù)10 min。PCR產(chǎn)物采用Agencourt AMPure XP beads純化和緩沖液中洗脫。PCR擴增產(chǎn)物采用安捷倫科技2100生物分析儀進行質(zhì)檢，合格后進行文庫構建。采用Illumina MiSeq測序平臺進行250 bp×2雙末端測序。下機后，要進行測序原始數(shù)據(jù)整理、過濾及質(zhì)量評估；序列進行質(zhì)控過濾后，接下來進行OTUs列表生成及注釋。

1.6 數(shù)據(jù)處理 測序完成后，對原始數(shù)據(jù)進行處理，步驟如下：（1）去掉質(zhì)量低、模糊的數(shù)據(jù)；（2）利用FLASH 軟件（v1.2.11）對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)短序列快速長度調(diào)整進行配對連接，獲得相應序列；（3）使用UPARSE軟件（v7.0.1090）對獲得的序列按97% cutoff值進行OUT歸類劃分，嵌合體序列使用UCHIME（v4.2.40）檢測與Gold數(shù)據(jù)庫進行比較；（4）根據(jù)最小置信度閾值為0.6，利用遺傳算法對OTU代表序列進行分類，采用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）分類器v.2.2進行OTU分類，然后采用QIIME v1.8.0在Greengenes數(shù)據(jù)庫v201305上進行分析；（5）使用USEARCH-global將所有序列與OTU進行比較，以獲得各樣品OTU豐度統(tǒng)計表；（6）根據(jù)OTU在每個樣本中所包含的序列數(shù)，構建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件；（7）采用MOTHUR（v1.31.2）和QIIME軟件（v1.8.0）對樣品序列進行Alpha、Beta多樣性分析；（8）采用QIIME軟件（v1.8.0）進行樣本聚類分析；（9）基于UPGMA、KEGG 和COG數(shù)據(jù)庫，采用PICRUSt軟件進行功能預測；（10）使用R軟件，根據(jù)OTU豐度矩陣和樣本分組數(shù)據(jù)構建PCoA分析，評估微生物群落的整體差異，根據(jù)OTU豐度矩陣表，使用R軟件對豐度前50名的微生物屬進行聚類分析并繪制heatmap聚類圖。

2 結果

2.1 臨床樣本統(tǒng)計分析 本研究共納入60名受試者，其中濕熱蘊結組、瘀熱組滯組與健康對照組各20人。入組人群的基本資料見表1。

表1 臨床研究人群基本資料

2.2 腸道菌群16SrDNA測定結果 60份糞便樣本總共獲得7 562 932條有效序列，人均126 049條clean reads，測序平均覆蓋度為98.16%。

2.3 腸道菌群物種注釋 依據(jù)測序結果，對測出的序列進行注釋，依照界、門、綱、目、科、屬和種對腸道菌群進行了注釋。測出的OTU總數(shù)為11 013個，對其進行注釋后，得到門共計11個，綱共計19個，目共計27個，科共計52個，屬共計138個，種共計226個。

圖1展示了綱水平的注釋結果，可進一步明確各個樣本的菌群分布情況，出現(xiàn)的菌群按照門水平平均相對豐度（relative abundance，RA）由高到低前5名分別為：Bacteroidetes（平均RA 為44.21%），F(xiàn)irmicutes（平均RA 為42.25%），Proteobacteria（平均RA為8.14%），F(xiàn)usobacteria（平均RA為2.52%），Verrucomicrobia（平均RA為1.45%）。在屬水平，按照平均相對豐度由高到低前5名分別為：Bacteroides（平均RA為31.02%），Megamonas（平均RA為11.52%），Prevotella（平均RA為10.18%），Unclassified（平均RA為5.79%），F(xiàn)aecalibacterium（平均RA為4.46%）。

圖1 3 組樣本在綱水平的物種組成

2.4 腸道菌群的多樣性比較分析 Alpha多樣性指數(shù)（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）顯示瘀熱阻滯組Alpha多樣性指數(shù)高于健康人群，而濕熱蘊結組的Alpha多樣性指數(shù)低于健康人群。上述4種多樣性指數(shù)值越高,表明群落的多樣性越高。3組比較，濕熱蘊結組略低于健康對照組，而瘀熱阻滯組高于濕熱蘊結組及健康對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖2）

圖2 3 組間Alpha 多樣性指數(shù)

Beta（β）多樣性分析可以體現(xiàn)不同組之間的腸道菌群是否存在差異。β多樣性分析顯示：濕熱蘊結組顯著低于健康人群（R=0.052，P=0.007）；瘀熱阻滯組高于健康人群，差異無統(tǒng)計學意義（R=0.027，P=0.32），濕熱蘊結組低于瘀熱蘊結組，但差異無統(tǒng)計學意義（R=0.035，P=0.108），3組間菌群比較，差異有統(tǒng)計學意義（R=0.051，P=0.025）。（見圖3）

圖3 3 組間Beta 多樣性PCoA 分析

2.5 3組間菌群組成差異分析 菌屬豐度排在前10的為Bacteroidia、Clostridia、Negativicutes、Gammaproteobacteria、Fusobacteriia、Verrucomicrobiae、Actinobacteria、Bacilli、Betaproteo bacteria、Erysipelotrichia。其中濕熱蘊結組、瘀熱阻滯組與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的菌群為Bacteroidia（相對豐度降低）、Negativicutes（相對豐度升高）、Actinobacteria（相對豐度升高）、Bacilli（相對豐度升高）。NMDS分析證實3組在腸道菌群屬水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（見圖4）

圖4 3 組間菌群組成差異分析

2.6 3組間菌群LEfSe分析 從LEfSe LDA圖可以看出3組間的差異菌群，篩選出有顯著差異Biomaker。圖中顯示瘀熱阻滯組的多樣性較豐富，代表性菌群較多，濕熱蘊結組次之，健康對照組最少。（見圖5）

圖5 3 組間菌群LEfSe 分析

2.7 3組間屬水平菌群結構差異熱圖分析 熱圖可顯示各樣本及組間的物種組成及豐度。與健康對照組比較，濕熱蘊結組、瘀熱阻滯組Bacteroidia、Fusobacteriia豐度降低，Clostridia、Negativicutes、Actinobacteria、Bacilli豐度升高。瘀熱阻滯組菌屬中Prevotella 菌群豐度上升，Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XlVb、Butyricimonas豐度降低；濕熱蘊結組菌屬中Bacteroides 菌群豐度上升，Paraprevotella、Dorea、Romboutsia豐度降低；健康對照組菌屬中Bacteroidia菌群豐度上升，Lactobacillus、Faecalicoccus、Pseudoflavonifractor、Acidaminococcus、Clostridium_IV、Dialister豐度降低。（見圖6）

圖6 基于腸道菌群屬水平差異物種的heatmap 聚類圖

3 討論

痛風是一種單鈉尿酸鹽沉積所致的晶體相關性關節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂及（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關，屬代謝性風濕病范疇。我國痛風的患病率為1%～3%，逐年上升且呈年輕化趨勢[11]。高嘌呤飲食會導致痛風發(fā)作，具體機制尚不清楚。人體存在數(shù)量巨大的腸道菌群，對人的生理、病理有重要影響[12]。這些影響包括關節(jié)促炎與抗炎反應,與關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展有關[13]。中醫(yī)學認為，痛風急性發(fā)作最常見的病因病機是濕濁瘀熱痹阻關節(jié)[14]?！吨嗅t(yī)內(nèi)科病證診斷療效標準》有關痛風的證候分類將痛風發(fā)作期的證型分為濕熱蘊結證與瘀熱阻滯證等證型[6]。這2種證型客觀的物質(zhì)基礎，以及其與腸道菌群的關聯(lián)尚不明確。因此，本研究擬探討痛風急性發(fā)作期的腸道菌群變化及其與中醫(yī)證型的相關性。

本研究納入人群主要為中老年男性，男性占85%以上，符合痛風發(fā)病的優(yōu)勢人群。痛風患者體質(zhì)量均存在超重現(xiàn)象，明顯高于健康人群，且50%以上合并高血壓，較多合并糖尿病、高脂血癥、腎結石及腎功能不全，與國內(nèi)有關痛風流行病學報道基本一致[15]。

本研究通過16SrDNA測序發(fā)現(xiàn)，痛風患者的腸道菌群與健康人群存在顯著差異，濕熱蘊結證與瘀熱阻滯證的痛風患者腸道菌群也存在差異。痛風急性發(fā)作期，主要表現(xiàn)為Bacteroidia豐度降低，Negativicutes、Actinobacteria、Bacilli豐度升高。而在不同證型之間，瘀熱阻滯組菌屬中Prevotella菌群豐度上升，Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XlVb、Butyric imonas豐度降低；濕熱蘊結組菌屬中Bacteroides菌群豐度上升，Paraprevotella、Dorea、Romboutsia豐度降低。這些升高的菌群絕大多數(shù)為致病菌，與炎癥、免疫密切相關，而降低的為益生菌，與抗炎作用有關[16-18]。因此，可以從腸道菌群的角度闡釋痛風出現(xiàn)急性炎癥的部分機制。

中醫(yī)辨證是中醫(yī)四診資料的高度概括，包括癥狀、體征、舌脈，這些變化與患者體質(zhì)密切相關。本研究根據(jù)中醫(yī)辨證進行分組，研究不同證型之間的腸道菌群差異，以尋找這些證型客觀的物質(zhì)基礎。腸道菌群的變化與人的體質(zhì)有密切關系[19-20]，這或許可以解釋痛風急性發(fā)作期不同證型的菌群差異。目前有學者進行了中醫(yī)證型與腸道菌群的相關研究，但未見痛風的中醫(yī)證型與腸道菌群關系的相關研究報道。如周夢玲等[21]發(fā)現(xiàn)帕金森病內(nèi)熱證擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低；安明偉等[22]研究表明慢性腹瀉脾胃濕熱證患者腸道需氧菌（腸桿菌、腸球菌）豐度升高；張寧等[23]研究發(fā)現(xiàn)寒凝血瘀證模型組大鼠中Firmicutes顯著上調(diào)，Bacteroidetes顯著下調(diào)。這些研究與本研究相似，均證實了腸道菌群變化與中醫(yī)證型的相關性。

本研究從腸道菌群的角度闡釋了痛風急性發(fā)作期不同證型與腸道菌群失調(diào)的關系，并為不同證型找到了可能的標志菌屬，為中醫(yī)辨證論治提供了客觀物質(zhì)基礎，也可能為痛風急性發(fā)作的機制提供了研究線索。但本研究屬于探索性研究，發(fā)現(xiàn)的菌群尚需進一步驗證，如采用菌群移植法進一步驗證。因為本研究納入的均為住院患者，病例數(shù)偏少，兩種中醫(yī)證型在年齡、BMI、病程上存在差異，所以在病例選擇方面可能存在偏倚。因此，有必要擴大病例來源，增加樣本量，使得各組在基線水平保持一致。