武 旭，吳亞楠，閆海英，張麗娟

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.空軍第九八六醫(yī)院第五門診部，陜西 西安 710061；3.潼關(guān)縣人民醫(yī)院，陜西 渭南 714300）

天麻（Gastrodiae Rhizoma）為蘭科植物天麻Gastrodia elata BI.的干燥塊莖，立冬后至次年清明前采挖，洗凈蒸透敞開低溫干燥。天麻具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，臨床上常用于治療癲癇抽搐、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風(fēng)濕痹痛、小兒驚風(fēng)、破傷風(fēng)等[1]。天麻中含有酚類、甾醇類、有機(jī)酸類、多糖類等化合物[2-3]。天麻具有鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁、抗焦慮、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性[4]。柞水天麻產(chǎn)地加工方法一般進(jìn)行蒸或煮30 min，直至手捏會(huì)發(fā)軟，對(duì)光照看時(shí)見到半透明無實(shí)心，取出用木板壓扁后充分干燥；或新鮮天麻直接切4 mm厚片后烘至半干，壓平后充分干燥；云南省尚有天麻凍干片，為新鮮天麻切厚片后冷凍干燥的處理方法。但鮮切天麻片受中藥飲片產(chǎn)地鮮切合法性影響，僅部分省份如湖北省開展了鮮切天麻片的炮制規(guī)范公示，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局僅將天麻作為藥食同源試點(diǎn)品種，還尚未納入藥食同源目錄進(jìn)行管理。此類鮮切片多作為保健食品，其藥品屬性還需結(jié)合各省的法規(guī)規(guī)定。蒸煮的目的即起到“殺酶保苷”的作用，同時(shí)便于塊莖類藥材迅速干燥不至霉變[5-6]。天麻為異養(yǎng)型的藥用植物，它的種植栽培在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)發(fā)展中起著重要的作用，不同的產(chǎn)地加工和干燥方法都會(huì)影響藥材的質(zhì)量。筆者采用響應(yīng)面法優(yōu)化柞水天麻的干燥工藝，以天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、總多糖和浸出物含量為考察指標(biāo)，優(yōu)化天麻藥材產(chǎn)地加工工藝，為發(fā)展天麻產(chǎn)業(yè)，以期保證藥源提供可靠方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2030 Plus島津高效液相色譜儀（日本島津公司，配置LC-2030 UV檢測(cè)器）；NewCLassic MS-S電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；XM-P102H無極調(diào)功超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；0.22 μm微孔濾膜（天津杉羽科技有限公司）；HH-2電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；L5型紫外-可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；UPL-10L超純水機(jī)（四川卓越水處理有限公司）。

1.2 試藥 天麻素（批號(hào)：T10M9F55562，純度≥98.0%）、對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)：H21D6Q7813，純度≥98.0%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；巴利森苷A（批號(hào)：PS011129，純度≥98.0%）、巴利森苷B（批號(hào)：PS011138，純度≥98.0%）、巴利森苷C（批號(hào)：PS011140，純度≥99.0%）、巴利森苷E（批號(hào)：PS012053，純度≥99.0%）均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。乙腈為色譜純，無水乙醇、苯酚、硫酸等其他試劑均為分析純。新鮮天麻藥材由柞水縣世紀(jì)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王昌利教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata BI.的干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻藥材的加工 2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定將新鮮天麻凈制后，蒸制透心低溫干燥即得。柞水產(chǎn)地通常將天麻蒸透后用木板壓扁，白天日曬，夜晚炕烘一周即可。也有文獻(xiàn)報(bào)道將天麻藥材置于55 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，至藥材含水量在15%以下（期間取出發(fā)汗2次）[7]。綜合考慮暫定新鮮天麻產(chǎn)地加工工藝為蒸透后55 ℃干燥5 d。

2.2 天麻藥材含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性條件 色譜柱為Agilent5 TC-（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相；按照0～10 min，3%A～10%A；10～15 min，10%A～12%A；15～25 min，12%A～18%A；25～40 min，18%A；40～42 min，18%A～95%A，梯度洗脫。流速：0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按照各個(gè)目標(biāo)峰計(jì)算應(yīng)不低于7 000，分離度不得低于1.6。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品，用甲醇:水（3∶97）溶液配制成含對(duì)羥基苯甲醇（0.079 mg/mL）、天麻素（1.560 mg/mL）、巴利森苷A（0.412 mg/mL）、巴利森苷B（0.347mg/mL）、巴利森苷C（0.371mg/mL）、巴利森苷E（0.145mg/mL）的混合對(duì)照品溶液。色譜圖見圖1A。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，振搖2 h后稱定質(zhì)量，加熱回流3 h，放冷稱定，用乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)眉状?水（3∶97）溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得，色譜圖見圖1B。

圖1 HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液2、8、12、16、20、24 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各對(duì)照品的線性關(guān)系考察結(jié)果見表1，可知各成分在線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表1 天麻混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.5 精密度試驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各成分對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的峰面積和保留時(shí)間。天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E混標(biāo)的RSD值分別為0.13%、0.12%、0.32%、0.63%、0.41%、0.21%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一天麻藥材樣品分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積。測(cè)得天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E含量的RSD值分別為1.24%、1.41%、1.03%、1.22%、1.47%、2.01%，表明該方法12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份天麻藥材照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下上述色譜條件，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E含量的RSD值分別為1.27%、1.35%、1.43%、1.72%、1.57%、2.33%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的1 g天麻藥材6份加適量天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E對(duì)照品，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，進(jìn)樣，記錄峰面積。天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E的平均回收率和RSD值見表2，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 天麻總多糖含量的測(cè)定

2.3.1 葡萄糖對(duì)照品溶液的制備 精密稱取恒重后的無水葡萄糖對(duì)照品5.015 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得50.15 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液[8]。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取供試品粉末約0.5 g，精密稱定，加95%乙醇100 mL回流提取1 h，趁熱過濾，殘?jiān)?5%乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘?jiān)盀V紙加蒸餾水100 mL，回流提取2 h，趁熱過濾，用熱水將殘?jiān)疤崛∪萜飨礈?次，每次10 mL，洗液與濾液合并，移入250 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得[9]。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0、20、40、60、80、100 μL，分別置于10 mL試管中，分別加入蒸餾水使其總體積達(dá)到1.0 mL，搖勻，分別加入5%苯酚溶液1.5 mL，搖勻，迅速滴入濃硫酸5.0 mL，搖勻。靜置10 min，水浴加熱15 min，取出放冷，以0 μL的溶液作為空白對(duì)照，用苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖線性回歸方程為A=1.830 9C+0.032 4，R2＝0.992 6，說明葡萄糖質(zhì)量濃度在0～0.668 6 mg/mL范圍內(nèi)與紫外吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 將葡萄糖對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄吸光度，經(jīng)計(jì)算RSD值為1.8%，表明儀器有良好的精密度。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一天麻藥材樣品分別在0、2、4、6、8 h測(cè)的吸光度，經(jīng)計(jì)算RSD值為1.0%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份天麻藥材照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品進(jìn)樣測(cè)得吸光度，計(jì)算RSD值為2.60%，表明實(shí)驗(yàn)方法有良好的重復(fù)性。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的天麻藥供試品溶液0.5 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL葡萄糖對(duì)照品，照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品進(jìn)樣計(jì)算平均加樣回收率及RSD值。天麻藥材總多糖的平均回收率和RSD值見表3，結(jié)果表明該方法加樣回收率良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 醇溶性浸出物的測(cè)定 參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201)項(xiàng)下的冷浸法[9]測(cè)定。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 蒸制時(shí)間考察 稱取新鮮天麻藥材常壓蒸制，于蒸鍋圓汽后分別在10、20、30、40、50、60 min時(shí)間節(jié)點(diǎn)取天麻藥材。結(jié)合對(duì)光照看透心和切開看透心的方法判斷是否蒸透。天麻鮮藥材蒸制20 min時(shí)中心仍有硬心，30 min即可達(dá)到透心的結(jié)果，因此確定30 min為新鮮天麻蒸制透心時(shí)間。

2.5.2 干燥溫度考察 稱取新鮮天麻藥材5份，常壓蒸制30 min，分別在35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃條件下干燥5 d，測(cè)定各樣品中天麻素等6種成分，醇溶性浸出物和總多糖的含量，計(jì)算總評(píng)歸一值[根據(jù)，總評(píng)歸一值OD=（d1+d2+d3…+dk）/k，其中Ymin為指標(biāo)中最小值，Ymax為指標(biāo)中最大值，k為指標(biāo)數(shù)][10]，同時(shí)根據(jù)水分測(cè)定結(jié)果選擇合適的干燥溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻干燥溫度過高導(dǎo)致有效成分劇烈降低，也符合藥典規(guī)定的低溫干燥的要求，結(jié)合水分測(cè)定結(jié)果可知35 ℃時(shí)天麻藥材干燥5 d未達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定水分要求（17.6），55 ℃時(shí)水分達(dá)標(biāo)且含量測(cè)定OD值也最優(yōu)，后續(xù)以45℃、55 ℃和65 ℃進(jìn)一步考察最佳干燥溫度。

2.5.3 干燥時(shí)間考察 稱取新鮮天麻5份，常壓蒸制30 min，在55 ℃條件下干燥3、4、5、6、7 d。測(cè)定各樣品中天麻素等6種成分，醇溶性浸出物和總多糖的含量，計(jì)算OD值，同時(shí)根據(jù)水分測(cè)定結(jié)果選擇合適的干燥溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蒸透心天麻55 ℃干燥4 d后水分即可達(dá)標(biāo)，干燥時(shí)間越長(zhǎng)含量越高，在第6天的時(shí)候基本穩(wěn)定，后續(xù)以5、6、7 d進(jìn)一步考察最佳干燥溫度。

圖2 干燥溫度及干燥時(shí)間的單因素考察結(jié)果圖

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化天麻加工工藝 采用Design-Expert 11軟件設(shè)計(jì)中心復(fù)合法試驗(yàn)，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取天麻干燥溫度（A）和干燥時(shí)間（B）作為2個(gè)考察因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，見表4。以天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、總多糖和醇溶性浸出物含量總評(píng)歸一值（OD值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而對(duì)實(shí)驗(yàn)中選取的2個(gè)因素進(jìn)行考察和優(yōu)化。

表4 中心設(shè)計(jì)響應(yīng)面法因素水平表

對(duì)中心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表5～6，以天麻含量總評(píng)OD值為響應(yīng)值，對(duì)干燥溫度和干燥時(shí)間多元線性回歸二項(xiàng)式方程擬合，擬合的方程模型：OD=0.915-0.2A-0.003 8B-0.589 04A2-0.168 0B2，擬合得到的回歸方程P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干燥時(shí)間和干燥溫度對(duì)OD值的影響顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ洼^為顯著（P＜0.01），決定系數(shù)R2=0.979 1體現(xiàn)出該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，可應(yīng)用于天麻含量總評(píng)值的預(yù)測(cè)。OD值與干燥溫度和干燥時(shí)間的三維效應(yīng)面曲線見圖3。以O(shè)D值最大值為目標(biāo)，根據(jù)Design Expert 12實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得最佳天麻加工最優(yōu)工藝參數(shù)為干燥溫度為47.77 ℃，干燥時(shí)間為7 d，天麻藥材含量預(yù)測(cè)最大值為0.975。

圖3 干燥溫度及干燥時(shí)間的交互作用響應(yīng)面圖

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表6 方差分析表

2.7 天麻產(chǎn)地加工工藝驗(yàn)證 由Expert-design 11.0軟件CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，預(yù)測(cè)到天麻最佳干燥工藝為蒸制30 min透心后，在47.77 ℃下干燥7 d。結(jié)合實(shí)際操作情況，將天麻的干燥溫度確定為50 ℃。該條件下制備3批天麻藥材，測(cè)定結(jié)果見表7，平均OD值為0.979 8，接近且優(yōu)于預(yù)測(cè)OD值0.975，證明回歸模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，所優(yōu)化出的天麻產(chǎn)地加工工藝具有較好的重復(fù)性和操作性。

表7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果（n=3）

圖4 天麻藥材圖

3 討論

天麻為常用的名貴中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，天麻在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，且《本草綱目》《開寶本草》等諸多中醫(yī)藥古籍中均有天麻的記載。天麻素為其主要的有效成分，具有良好的鎮(zhèn)痛作用，臨床上多用于治療頭痛、眩暈、神經(jīng)痛、冠心病、心絞痛等[8-9]。在現(xiàn)代應(yīng)用中為了防止天麻素的分解和酚類成分酶促反應(yīng)，天麻在干燥之前必須進(jìn)行“斷生”以達(dá)到“殺酶保苷”的作用，但天麻素和自身的多糖等成分極易溶于水，故在天麻炮制加工過程中往往采用蒸制法而非煮制。

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》以天麻素，對(duì)羥基苯甲醇，巴利森苷A、B、C、E 6種成分的色譜圖，作為特征圖譜。同時(shí)，巴利森苷A、B、C、E在藥材及飲片中含量較高，是天麻中主要的入血成分[11-12]。故本實(shí)驗(yàn)以6種特征成分和總多糖及醇溶性浸出物含量作為考察指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)天麻藥材的干燥工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計(jì)能夠?qū)?shí)驗(yàn)中的每個(gè)水平進(jìn)行連續(xù)分析從而得到直觀的結(jié)果[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以天麻的蒸制時(shí)間、干燥溫度、干燥時(shí)間作為3個(gè)考察因素，并以各個(gè)考察指標(biāo)的OD值進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中干燥溫度對(duì)天麻品質(zhì)影響較大，高溫干燥處理會(huì)導(dǎo)致天麻素類成分急劇下降，因此天麻在加工時(shí)應(yīng)盡量保持較低溫度，又要考慮干燥效率避免霉變。筆者應(yīng)用響應(yīng)面法分析優(yōu)選出天麻藥材的最佳干燥工藝為蒸制時(shí)間30 min，干燥溫度50 ℃，干燥時(shí)間7 d，為天麻藥材的干燥加工提供了可靠依據(jù)。