劉 楊，蘇 維，沈冰冰，謝 謙，袁漢文，蔣 賽，鄭金鳳，劉雁鳴，王 煒

（1.湖南省藥品檢驗研究院/湖南藥用輔料檢驗檢測中心，湖南 長沙 410001；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中醫(yī)藥民族醫(yī)藥國際聯(lián)合實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013）

土家族藥物“白三七”是土家族珍稀瀕危的名貴“七”類中草藥之一，被稱為“土家族神參”[1-2]；作為土家族“七”藥的代表藥，白三七又被稱為竹節(jié)參、北三七、竹節(jié)三七、算盤七、竹葉蓮、九節(jié)龍、大葉三七等，長期應(yīng)用于土家族臨床實踐中[3-4]?！锻良易逅幬镏尽分杏涊d，白三七為五加科植物竹節(jié)人參Panax japonicus C.A.Mey.的根莖，用于治療咳血、吐血、跌打損傷、產(chǎn)后瘀血腹痛、外傷出血[5-6]。白三七作為中藥竹節(jié)參，被收載于2020年版《中華人民共和國藥典》一部，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補虛強壯的功效，用于治療癆嗽咯血、跌仆損傷、咳嗽痰多、病后虛弱[7]。

由于環(huán)境污染和中藥材生產(chǎn)加工、貯藏、流通過程中影響，中藥材的重金屬感染風(fēng)險大大提高[8-11]。中藥材中的重金屬及有害元素進入人體蓄積后會產(chǎn)生一些急性或慢性的影響，損害人的健康，主要有神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和內(nèi)臟的損傷[12-15]。為了提高中藥材質(zhì)量、促進中藥材的國際化推廣，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心牽頭制訂的《中醫(yī)藥——中藥材重金屬限量》國際標準，規(guī)范檢測中藥材重金屬含量，評價重金屬和有害元素感染風(fēng)險[16-17]。

作為一種長期在土家族區(qū)域使用的藥物，由于白三七種植和炮制過程沒有具體的規(guī)范限定，其重金屬含量并沒有進行評估。2020年版《中華人民共和國藥典》中未對白三七的重金屬含量進行控制，在使用中會帶來嚴重的健康風(fēng)險，因此有必要對其重金屬感染風(fēng)險進行評估。筆者主要采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS），結(jié)合2020年版《中華人民共和國藥典》通則9302中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則，建立準確靈敏的方法，對銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）、汞（Hg）和鉛（Pb）的含量進行測定，根據(jù)中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險評估技術(shù)指導(dǎo)原則評估其對人體造成的影響，以及質(zhì)量標準中增加重金屬檢查項目的必要性。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 iCAPQc電感耦合等離子體質(zhì)譜分析儀（美國Thermo Fisher Scientific）；GenPure UV-TOC/UF超純水儀（美國Thermo Fisher Scientific）；Mars6-Xpress微波消解儀（美國CEM）；MS304S電子分析天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 試劑與試藥 銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）多元素標準溶液（批號：20C114，濃度：100 μg/mL）、汞（Hg）標準溶液（批號：17C021-4，濃度：1 000 μg/mL）、鉛（Pb）標準溶液（批號：196020-4，濃度：1 000 μg/mL）、金（Au）標準溶液（批號：17B035-3，濃度：1 000 μg/mL）均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鈧（Sc）、銦（In）、鍺（Ge）、鉍（Bi）內(nèi)標混合溶液（批號：4-75MKBY2，濃度：100 μg/mL）購于美國安捷倫科技有限公司；硝酸（優(yōu)級純，批號：20201023）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。共收集白三七樣品10批（B-1～B-10），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王煒教授鑒定為五加科植物竹節(jié)人參Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根莖，樣品信息見表1。

表1 白三七樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 工作條件 等離子體功率為1 550 W，輔助氣體流量為0.80 L/min，載氣流量為1.0 L/min，冷卻氣體流量為14.0 L/min，采樣深度為5.0 mm，采樣時間為90 s，霧化室溫度為2.7 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速為40.0 r/min，重復(fù)3次，掃描次數(shù)為100次，分析模式為KED模式。ICP-MS所用輔助氣、冷卻氣和載氣均為高純氬氣。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標溶液的制備 精密量取混合內(nèi)標溶液1 mL，用2%的硝酸溶液稀釋制成各元素質(zhì)量濃度為100 ng/mL的溶液，即得。

2.2.2 標準曲線溶液的制備 精密量取銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）多元素標準溶液2.5 mL，汞（Hg）0.05 mL、鉛（Pb）0.25 mL置50 mL量瓶中，用2%的硝酸定量稀釋至刻度，搖勻，作為混合標準貯備溶液；分別精密量取標準貯備液0.05、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL置50 mL量瓶中，用2%的硝酸稀釋至刻度，搖勻，制成標準曲線系列溶液（1）～（6）。

2.2.3 供試品溶液的制備 白三七粉碎過2號篩，取粉末約0.1 g，精密稱定，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入3 mL硝酸，置80 ℃電熱套中預(yù)消解1 h，冷卻，過夜。放入微波消解裝置中消解。消解完全結(jié)束后，冷卻，置趕酸儀中110 ℃趕酸至消解液約1 mL（消解程序見表2），用2%硝酸轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加Au（1 000 μg/mL）20 μL，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

表2 微波消解程序

2.2.4 空白溶液的制備 供試品空白：除不加入待測試樣外，其他均按“2.2.3”項下方法操作。

標準溶液空白：2%硝酸。

2.3 測定方法的制備 待測元素63Cu、75As、111Cd、202Hg、208Pb分別選擇以45Sc、74Ge、115In、209Bi為內(nèi)標。以元素強度與內(nèi)標強度比值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線讀取供試品溶液中各元素的濃度，計算各元素含量。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項下標準曲線溶液（1）～（6）進行測定，以元素強度與內(nèi)標強度比值（y）為縱坐標，以各元素濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表3。5種元素的線性關(guān)系良好。

表3 各元素線性方程、檢測限

2.5 檢測限與定量限 取“2.2.4”項下樣品空白溶液適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定11次，計算各元素濃度的標準偏差。以3倍標準偏差所對應(yīng)的濃度值作為檢測限，10倍標準偏差所對應(yīng)的濃度值作為定量限，結(jié)果見表3。

2.6 精密度試驗 精密量取“2.2.2”標準溶液（3），按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣6次，以各元素強度的相對標準偏差（RSD）為考察指標，Cu、As、Cd、Hg和Pb元素的RSD分別為0.78%、0.75%、0.64%、0.99%和0.53%，說明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取白三七（B-1），按“2.2.3”項下方法，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下試驗條件測定。結(jié)果Cu、As、Cd、Hg 和Pb 平均含量分別為17.98、0.50、0.53、0.69、0.93 ng/mL；RSD分別為2.30%、1.55%、1.93%、6.35%、3.19%（n=6），表明儀器重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取供試品0.1 g，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加硝酸3 mL，再精密加入0.25 mL混合元素貯備液，按“2.2.3”項下方法，平行制備6份供試品溶液，同法制備空白溶液，按“2.1”項下試驗條件測定并計算回收率。結(jié)果見表4。表明方法準確度良好。

表4 平均回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測定與結(jié)果分析 精密稱取供試品0.1 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下試驗條件測定，每批樣品平行測定2次，計算樣品中元素的含量。結(jié)果見表5。將所有樣品的測定，使用SPSS 24.0及SIMCA 14.1軟件進行主成分分析，結(jié)果見表6～7、圖1～2。

表5 樣品銅、砷、鎘、汞、鉛元素結(jié)果表（μg/g）

表6 主成分的初始特征值

圖1 不同產(chǎn)地白三七中重金屬元素的主成分得分圖

結(jié)果表明，10批樣品中Cu的含量為3.66～8.99 μg/g，As的含量為0.11～1.12 μg/g，Cd的含量為0.03～0.31 μg/g，Hg的含量為0.01～0.35 μg/g，Pb的含量為0.16～4.72 μg/g，根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》通則9302中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則，B-1樣品中Hg元素含量超標，其他元素含量均在限度范圍內(nèi)。對不同產(chǎn)地白三七中樣品進行主成分分析（PCA），表6結(jié)果表明前2個成分的特征值均大于1，累積方差貢獻率為79.033%，可提取這2個主成分的因子進行分析，表7成分矩陣表明，Cd和Pb元素在第一主成分因子中的負荷量較大，分別為0.932和0.822，因此Cd和Pb元素為收集到的10批樣品中重金屬元素殘留的主要差異。通過PCA分析，從圖1可知不同產(chǎn)地白三七中重金屬元素和有害元素有一定的區(qū)別，但不同產(chǎn)地間不能明顯的區(qū)分開；在此基礎(chǔ)上，對超過2批的產(chǎn)地進行OPLS-DA分析，結(jié)果見圖2，云南產(chǎn)白三七中所含重金屬和有害元素的量與湖南產(chǎn)均能較好的聚類，說明不同產(chǎn)地白三七中重金屬和有害元素含量有差異。

圖2 不同產(chǎn)地白三七中重金屬元素的OPLS-DA 得分圖

表7 前2 個成分載荷因子矩陣

靶標危害系數(shù)法（THQ）是常用于評估重金屬污染對人體健康影響的一種方法[18]。但是針對中藥外源性有害殘留物的安全風(fēng)險，中國食品藥品檢定研究院建立了《中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險評估技術(shù)指導(dǎo)原則》，通過日暴露量（Exp）、危害指數(shù)（HI）和暴露限量（MOE）對重金屬和有害元素的風(fēng)險進行評估[19]。研究采用此方法對收集到的10批白三七中重金屬和有害元素進行風(fēng)險評估。通過指導(dǎo)原則中公式1，5，6對Exp，HI和MOE分別進行計算，結(jié)果見表8。對于尚未建立健康指導(dǎo)值的As和Pb，其重金屬及有害元素的基準劑量下限值（BMDL）分別為1.3、3.0 μg/kg[20]。評估標準：HI＞1或MOE≤1為有風(fēng)險；HI≤1或MOE＞1為風(fēng)險較低。白三七中Cd的HI大于1，Pb的MOE小于1，具有較高的重金屬和有害元素殘留風(fēng)險，Cu、As和Hg風(fēng)險較低，但也有部分樣品存在風(fēng)險。

表8 白三七中重金屬和有害元素殘留量風(fēng)險情況

3 討論

中藥和民族藥的重金屬污染是限制其推廣使用的重要原因之一，白三七是土家族常用藥之一，由于野生資源的匱乏，已逐步開展了人工種植，但在種植和加工過程中容易受到重金屬污染。本實驗共收集了10批來自5個產(chǎn)地的白三七樣品，采用ICP-MS法對白三七中Cu、As、Cd、Hg和Pb的殘留量進行測定，并進行了方法學(xué)驗證；通過對收集到的不同產(chǎn)地樣品的重金屬和有害元素進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的白三七中Cd和Pb的殘留量有明顯區(qū)別；同時根據(jù)《中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險評估技術(shù)指導(dǎo)原則》對白三七中重金屬和有害元素的殘留進行風(fēng)險評估，評估結(jié)果也表明Cd、Pb殘留的風(fēng)險較高。

重金屬和有害元素殘留風(fēng)險也與藥材的入藥部位、產(chǎn)地、生長環(huán)境等都相關(guān)。白三七是以根莖入藥，對土壤中不同種類的重金屬元素的吸收富集作用不同，導(dǎo)致不同種類的重金屬元素含量有差異。土壤中的重金屬主要來自于工業(yè)排廢和化肥、農(nóng)藥的使用，因此在其種植過程中和質(zhì)量控制時，要考慮地理因素和肥料的使用對其重金屬元素含量的影響。

當前的質(zhì)量標準并未對白三七中重金屬和有害元素的殘留進行控制，具有一定的安全隱患。本實驗建立了一種準確、靈敏、簡便方法，用于檢測白三七中重金屬金屬元素殘留；通過風(fēng)險評估，發(fā)現(xiàn)了白三七具有重金屬和有害元素殘留的風(fēng)險，為白三七種植條件的選擇提供了參考，為白三七的安全用藥提供了指導(dǎo)，為白三七質(zhì)量標準的完善提供了科學(xué)依據(jù)。