張會(huì)濤，郄 濤

（保定市第一中心醫(yī)院西院，河北 保定 071000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）屬于嚴(yán)重的冠心病類型，在中老年人群中發(fā)病率極高，嚴(yán)重危害患者生命安全。研究發(fā)現(xiàn)，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平具有心肌梗死后心臟保護(hù)作用[1]。降香（dalbergia odorifera，DO）是一種用于臨床治療心腦血管疾病的中藥。既往研究表明，降香提取物對缺血再灌注導(dǎo)致的心臟損傷具有保護(hù)作用，可以降低心肌梗死大鼠心臟炎癥反應(yīng)[2-3]。另外，通過降低氧化應(yīng)激水平可以改善心功能[4]。但降香提取物在心肌梗死模型中是否發(fā)揮心臟保護(hù)作用尚不明確，其具體機(jī)制尚不清楚。故本研究通過建立急性心肌梗死模型，探討降香水提物是否通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/過氧化物增殖激活受體γ輔助激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator 1α，PGC-1α）信號通路降低氧化應(yīng)激水平、提高心肌能量代謝、改善心功能，以期為降香相關(guān)藥物的研發(fā)及AMI的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（冀）2018-008。飼養(yǎng)期間自由飲食飲水，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，明暗交替。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，確保動(dòng)物福利倫理，經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理福利批準(zhǔn)號：BDDYZXYY2019051601。

1.2 藥物與試劑 降香水提物（aqueous extract of dalbergia odorifera，DOA）（純度＞98%，西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號：20181206）；5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶（5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside,AICAR）（美國Sigma-Aldrich公司，批號：20190123）；TTC染料（美國Sigma公司，批號：20190322）；單磷酸腺苷（adenosinemonophosphate，AMP）試劑盒（批號：20181007）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）試劑盒（批號：20180815）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）試劑盒（批號：20190412）均購自南京卡米洛生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20180910）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20190405）均購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠AMPK抗體（批號：20180712）、p-AMPK抗體（批號：20180814）、PGC-1α抗體（批號：20190425）、p-PGC-1α抗體（批號：20190321）、GAPDH 抗體（批號：20180911）均購自美國SantaCruz公司。

1.3 主要儀器 RWD407型呼吸機(jī)（中國瑞沃德生命科技有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；電泳儀（北京六一電子儀器廠）；多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.5 造模方法 第7天給藥結(jié)束2 h后，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠建立急性心肌梗死模型。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，連接心電圖機(jī)，分離頸部肌肉，暴露氣管，連接呼吸機(jī)，輔助呼吸。于第3～4肋間分離皮層、肌肉層，暴露心臟，剪開心包，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間距離主動(dòng)脈3～4 mm處，6-0號無創(chuàng)縫合線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。以ST段抬高，左心室前壁變蒼白并持續(xù)30 min，為急性心肌梗死模型建造成功。假手術(shù)組大鼠僅開胸后，左冠狀動(dòng)脈前降支相同部位穿線，但不結(jié)扎[5]。造模過程中模型組和激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠各死亡2只，其余各組大鼠未死亡。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 心功能 術(shù)后第2天，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，胸部剃毛，彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢測各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）。

1.6.2 心肌能量代謝 脫頸處死大鼠，主動(dòng)脈采血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm。收集上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，加入終止液后，置于酶標(biāo)儀上，450 nm波長處測定A值，并根據(jù)做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清中ATP、ADP、AMP含量。

1.6.3 心肌梗死面積 剝離心臟，切取心尖部1/2部分，將心尖部橫向切成1～2 mm的薄片，置于1% TTC磷酸緩沖液中，37 ℃恒溫箱孵育20 min，避光并振蕩。之后，用水洗去多余染料，梗死區(qū)顯示為灰白色，非梗死區(qū)為磚紅色。甲醛固定后掃描，Image pro plus 6.0計(jì)算心肌梗死面積百分比=（心肌梗死面積之和/心肌總面積之和）×100%。

1.6.4 心肌組織病理學(xué)變化 取部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)包埋、脫水、切片（片厚4 μm）后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，行HE染色，中性樹膠封片后，置于顯微鏡下觀察。

1.6.5 線粒體氧化應(yīng)激水平 取200 mg心肌組織，置入盛有2mL冰生理鹽水的EP管中，勻漿至無組織塊，4 ℃3 000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，收集上清液。SOD活性和MDA含量測定均按照說明書操作。SOD活性測定用黃嘌呤氧化酶法，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，于波長550 nm處測定吸光度（A）值并計(jì)算SOD活性，波長532 nm處測定A值并計(jì)算MDA含量。

1.6.6 心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α、PGC-1α蛋白表達(dá) 取部分心肌組織，勻漿后，清洗3次，加入RIPA裂解液靜置30 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃煮沸5 min。按照分組依次上樣，每孔加入樣品20 μL，120 V電泳2 h，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜3次，室溫封閉1 h，p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α、PGC-1α和GAPDH（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，Image J軟件計(jì)算條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)量。

大海子水庫新建涵洞、閘井工程總投資284.92萬元，其中建筑工程、臨時(shí)工程、獨(dú)立費(fèi)用所占比重較大。經(jīng)過經(jīng)濟(jì)評價(jià)，本工程在經(jīng)濟(jì)上合理可行，且項(xiàng)目投入使用后各受益方需要分?jǐn)傎M(fèi)用，農(nóng)業(yè)灌溉作為最大的受益方完全可以承受新水價(jià)，因此該項(xiàng)目實(shí)施有較好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 模型組大鼠LVEF和LVFS均低于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），而高于激動(dòng)劑組（P＜0.05）；模型組大鼠LVEDD和LVESD均長于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），而短于激動(dòng)劑組（P＜0.05）。激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠LVEF和LVFS均低于降香水提物組（P＜0.05），而高于激動(dòng)劑組（P＜0.05）；激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠LVEDD和LVESD均長于降香水提物組（P＜0.05），而短于激動(dòng)劑組（P＜0.05），提示模型組大鼠心功能障礙，DOA可改善心功能。（見表1）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP含量比較 模型組大鼠血清ATP含量低于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），高于激動(dòng)劑組（P＜0.05），而ADP、AMP含量均高于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），低于激動(dòng)劑組（P＜0.05）。激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠血清ATP含量低于降香水提物組（P＜0.05），高于激動(dòng)劑組（P＜0.05），而ADP、AMP含量均高于降香水提物組（P＜0.05），低于激動(dòng)劑組（P＜0.05）。提示模型組大鼠線粒體能量代謝障礙，DOA可提高線粒體能量代謝。（見表2）

表2 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP 含量比較（，μg/L）

表2 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP 含量比較（，μg/L）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較 假手術(shù)組大鼠心肌未見梗死區(qū)域，模型組大鼠心肌梗死明顯；降香水提物組大鼠心肌梗死面積明顯小于模型組（P＜0.05）；激動(dòng)劑組大鼠心肌梗死面積明顯大于模型組（P＜0.05）；激動(dòng)劑+降香水提物組心肌梗死面積大于降香水提物組（P＜0.05），而小于激動(dòng)劑組（P＜0.05）。提示降香水提物可減小心肌梗死面積。（見表3、圖1）

圖1 各組大鼠心肌組織TTC 染色圖

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較（）

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與降香水提物組比較，bP＜0.05；與激動(dòng)劑組比較，cP＜0.05

2.4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變情況 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊致密，間質(zhì)無水腫；模型組和激動(dòng)劑組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，肌纖維斷裂，間質(zhì)水腫，且激動(dòng)劑組較模型組病變嚴(yán)重；降香水提物組大鼠心肌細(xì)胞病變減輕，趨于正常；激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠心肌細(xì)胞病變較降香水提物組加重，較激動(dòng)劑組減輕。（見圖2）

圖2 各組大鼠心肌組織病理改變圖（HE，×400）

2.5 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD活性比較 模型組大鼠心肌組織中MDA含量高于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），而低于激動(dòng)劑組（P＜0.05），SOD活性低于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），而高于激動(dòng)劑組（P＜0.05）；激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠MDA含量高于降香水提物組（P＜0.05），而低于激動(dòng)劑組（P＜0.05），SOD活性低于降香水提物組（P＜0.05），而高于激動(dòng)劑組（P＜0.05）。提示DOA能降低心肌梗死大鼠氧化應(yīng)激水平。（見表4）

表4 各組大鼠心肌組織中MDA 含量和SOD 活性比較（）

表4 各組大鼠心肌組織中MDA 含量和SOD 活性比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP＜0.05

2.6 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α及PGC-1α蛋白表達(dá)比較 5組大鼠心肌組織中AMRK、PGC-1α蛋白相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠心肌組織中p-AMPK和p-PGC-1α蛋白相對表達(dá)量均高于假手術(shù)組和降香水提物組（P＜0.05），而低于激動(dòng)劑組（P＜0.05）；激動(dòng)劑+降香水提物組大鼠心肌組織中p-AMPK、p-PGC-1α蛋白相對表達(dá)量均高于降香水提物組（P＜0.05），而低于激動(dòng)劑組（P＜0.05）。提示DOA能抑制心肌梗死大鼠心肌組織中AMPK/PGC-1α信號通路。（見表5、圖3）

圖3 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α、PGC-1α 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表5 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α 和PGC-1α 蛋白表達(dá)比較（）

表5 各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α 和PGC-1α 蛋白表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與降香水提物組比較，cP＜0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP＜0.05

3 討論

AMI常見于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂造成急性冠狀動(dòng)脈栓塞，限制或阻斷血液回流入心臟，引起心肌細(xì)胞缺血缺氧，造成心肌細(xì)胞死亡，心肌細(xì)胞的喪失和心肌纖維化導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭。線粒體為主要的能量合成場所，由于心肌細(xì)胞缺氧和缺少營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，線粒體功能障礙，ATP產(chǎn)生異常，活性氧生成過度，導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高[7-8]。降香通過降低氧化應(yīng)激水平，抑制細(xì)胞衰老進(jìn)程[9]。降香能激活HO-1降低炎癥反應(yīng)，對伴有小膠質(zhì)細(xì)胞激活的神經(jīng)退行性疾病具有改善作用[10]。冠心丹參方主要成分包括降香、丹參、三七，研究發(fā)現(xiàn)，冠心丹參方可有效拮抗糖尿病心肌病[11]。本研究的目的在于探討降香水提物是否對AMI大鼠具有心臟保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

本研究通過預(yù)先灌胃DOA，再進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的方法建立AMI大鼠模型，以探討DOA的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AMI大鼠LVEF、LVFS降低，LVEDD、LVESD增長，心功能下降，同時(shí)心肌梗死面積明顯增加，服用DOA的大鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD縮短，心肌梗死面積減少，提示DOA可改善AMI大鼠心功能。大鼠發(fā)生AMI時(shí)，線粒體能量代謝異常，ATP合成降低，ADP、AMP合成增加。本研究結(jié)果顯示，DOA可使AMI大鼠心肌線粒體ATP合成增加，ADP、AMP降低，改善線粒體功能障礙。

AMPK廣泛存在于真核細(xì)胞，可降低結(jié)腸炎小鼠模型炎癥反應(yīng)，減輕腸道損傷，增強(qiáng)衰老大鼠模型神經(jīng)元細(xì)胞自噬改善腦功能下降。雷諾拉嗪可通過抑制AMPK信號通路降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷程度。胡蘆巴苷牡荊可通過調(diào)節(jié)AMPK/ACC通路改善肥胖誘導(dǎo)的糖尿病腎病[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿可通過AMPK信號通路降低糖尿病腎病大鼠血糖水平，增強(qiáng)SOD活性，降低MDA水平，改善腎功能[16]。此外，AMPK還可以調(diào)節(jié)機(jī)體和細(xì)胞能量代謝[17]。PGC-1α是細(xì)胞代謝的中樞調(diào)節(jié)因子，AMPK/PGC-1α信號可通過參與調(diào)節(jié)線粒體生物合成和能量代謝，降低氧化應(yīng)激水平，改善線粒體功能障礙[18-19]。本研究中，大鼠發(fā)生AMI時(shí)，由于心肌細(xì)胞缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和缺氧，AMPK/PGC-1α信號通路被激活，p-AMPK和p-PGC-1α蛋白表達(dá)增加。降香水提物是否能調(diào)節(jié)該信號通路仍需進(jìn)一步研究。本研究通過AMI大鼠腹腔注射信號通路激動(dòng)劑AICAR，同時(shí)灌胃DOA，探討兩者之間的相互關(guān)系。結(jié)果表明，DOA可降低p-AMPK、p-PGC-1α蛋白表達(dá)，表明DOA可以調(diào)節(jié)AMPK/PGC-1α信號通路。

綜上所述，DOA可降低AMI大鼠氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)線粒體能量合成，改善AMI大鼠心功能障礙，可能是通過調(diào)節(jié)AMPK/PGC-1α信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。