鄂 遠，王雨辰

（常州市武進中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州 213139）

隨著人口的不斷老齡化，骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題[1]。流行病學調(diào)查[2]顯示，在50歲以上的人群中，尤其是女性，OP的患病率急劇上升，約40%會發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折（osteoporosis fracture，OPF）。相比于普通骨折，OPF愈合較難，是導致老年患者致殘和死亡的主要原因之一[3]。中醫(yī)在防治OPF中有其獨特優(yōu)勢，補腎活血湯為補腎、活血的中醫(yī)經(jīng)驗方，而腎主骨，因此被應(yīng)用于骨折等骨傷科疾病的治療[4]。骨折愈合包括間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）趨化歸巢、增殖和分化的炎癥階段，骨痂形成的修復(fù)階段，以及破骨細胞吸收和成骨細胞新骨骨質(zhì)形成的塑形階段[5]。其中，MSCs的趨化歸巢、增殖和分化是骨折正常愈合的前提?；|(zhì)細胞衍生因子-1α（Stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）/CXC趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）通路的激活為MSCs趨化、增殖和分化所必需，SDF-1α可引導MSCs向骨折處遷移并分化為成骨細胞，最終實現(xiàn)骨形成和骨愈合[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，骨質(zhì)疏松癥老年大鼠骨髓MSCs（bone MSCs，BMSCs）的成骨分化和遷移能力明顯減弱，可能與骨形成明顯減少有關(guān)，上調(diào)CXCR4水平可以改善BMSCs的遷移，可能有利于促進OPF愈合。本研究推測，補腎活血湯促進OPF愈合的作用可能與活化SDF-1α/CXCR4通路有關(guān)，并通過構(gòu)建OPF大鼠模型對此進行探究，以期為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6個月齡SPF級健康雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量310～330 g，由江蘇省中醫(yī)藥研究院采購，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0018。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由飲食，取材時將大鼠麻醉處死。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準并在3R原則下開展實驗。

1.2 藥物與試劑 補腎活血湯，方藥組成：菟絲子、熟地黃、補骨脂各18 g，杜仲、枸杞子、肉蓯蓉、當歸、獨活、沒藥、山萸肉各6 g，紅花3 g，所有中藥材購于本院中藥房。將上述中藥材在水中浸泡30 min，加入400 mL無菌水煎煮，最終濃縮至含生藥量1 g/mL備用。CXCR4拮抗劑AMD3100（純度≥98%，批號：A5602，Sigma公司）；大鼠骨橋素（Osteopontin，OPN）ELISA試劑盒（批號：D731102）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）ELISA試劑盒（批號：D731033）及骨鈣素（Osteocalcin，OCN）ELISA試劑盒（批號：D731045）均購自生工生物公司；兔源SDF-1α單抗試劑盒（批號：ab155090）、兔源CXCR4單抗試劑盒（批號：ab124824）、兔源OCN單抗試劑盒（批號：ab93876）、抗兔HRP-DAB免疫組化染色試劑盒（批號：ab64264）均購自Abcam公司。

1.3 主要儀器 uCT50顯微CT（SCANCO Medical AG公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Thermo）；QX-W550型生物力學測試機（上海企想儀器）；SMZ745光學顯微鏡（日本尼康）。

1.4 造模與分組 40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、補腎活血湯組和補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組，每組10只。大鼠麻醉固定后，備皮開腹，除對照組大鼠剪除卵巢附近脂肪組織外，其余各組大鼠剪除卵巢。正常飼養(yǎng)8周后，造模大鼠骨密度明顯低于對照組則骨質(zhì)疏松模型制備成功[9]。之后除對照組外，截斷其余3組大鼠的右側(cè)股骨，并插入克氏針，即成功建立骨折模型[9]，對照組大鼠不進行手術(shù)。術(shù)后X光檢查，股骨處有明顯骨折線則OPF模型制備成功。

1.5 實驗給藥 補腎活血湯組大鼠每天灌胃給予10 g/kg補腎活血湯[9]；補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠每天灌胃給予10 g/kg補腎活血湯的同時，骨折處皮下注射40 mmoL/kg AMD3100[10]治療，對照組和模型組大鼠分別灌胃和注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 血清骨因子OPN、ALP、OCN 末次治療24 h后麻醉處死各組大鼠。分離腹腔取腹主動脈血，并4 ℃3 000 r/min離心15 min取血清，用于血清因子檢測。將血清與大鼠OPN、ALP、OCN試劑盒試劑混勻后，按說明書檢測各因子水平。同時分離留取各組大鼠右側(cè)股骨，剔除肌肉、脂肪等多余組織，用于后續(xù)檢測。

1.6.2 骨微結(jié)構(gòu)指標 將大鼠麻醉后置于照射平臺上，采用X射線對股骨骨折處攝片，以評估骨折愈合情況。將“1.6.1”中股骨放在掃描專用圓筒中，設(shè)置掃描儀掃描參數(shù)為：55 kVp X射線、145 μA電流，以相同的方向進行掃描，每個平面采集1 000個圖像。通過SCANCO評估程序一鍵分析骨折處新生骨組織的結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨密度（BMD）、骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（TB.N）等，以評價新生骨質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)。

1.6.3 生物力學指標 采用力學測試機對各股骨進行三點彎曲試驗以評估其生物力學性能。將股骨樣品以相同方向放置在相距20 mm的兩個桿上，以1.0 mm/min的恒定速度將移動的十字頭力傳遞至中軸，并讀取儀器上骨剛性、骨最大載荷及彈性載荷等指標。

1.6.4 骨組織形態(tài)學觀察 股骨組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、EDTA溶液脫鈣、常規(guī)脫水等處理后，制備石蠟塊，從骨折處開始對股骨進行切片（4 μm/片），經(jīng)蘇木素染色、鹽酸分化、PBS脫色、伊紅復(fù)染色后，在光學顯微鏡下觀察。

1.6.5 股骨組織SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白 股骨石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗SDF-1α（1 ∶500）、CXCR4（1∶200）、OCN（1∶200）孵育10 h、抗小鼠IgG-Biotin（1∶500）二抗孵育1 h、鏈霉親和素-HRP綴合物孵育30 min、DAB顯色、蘇木素染液復(fù)染后，在顯微鏡下拍照。每張切片至少對6個視野進行免疫組化評分。

1.7 統(tǒng)計學方法 用Graphpad Prism 8或SPSS 25.00行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示，多組比較使用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q或Bonferroni-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨折愈合情況 對照組大鼠股骨骨折處未見骨折線。治療4周后，模型組、補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠股骨骨折處可見明顯骨折線和少量骨痂；補腎活血湯組大鼠股骨骨折處可見模糊骨折線和大量骨痂。（見圖1）

圖1 各組大鼠股骨X 射線圖像

2.2 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)及生物力學指標比較 與對照組比較，模型組大鼠骨體積分數(shù)、骨密度、骨小梁數(shù)量、骨剛性、骨最大載荷及骨彈性載荷均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血湯組大鼠骨體積分數(shù)、骨密度、骨小梁數(shù)量、骨剛性、骨最大載荷及骨彈性載荷均明顯升高（P＜0.05）；與補腎活血湯組比較，補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠骨體積分數(shù)、骨密度、骨小梁數(shù)量、骨剛性、骨最大載荷及骨彈性載荷均明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)及生物力學指標比較（）

表1 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)及生物力學指標比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血湯組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠骨折處骨組織形態(tài)比較 對照組大鼠骨組織排列較為規(guī)則，骨小梁間隙較大且數(shù)量較多；模型組、補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠骨折處有少量成骨細胞和新生骨組織；補腎活血湯組大鼠骨折處有較多成骨細胞和新生骨組織。（見圖2）

圖2 各組大鼠骨折處骨組織形態(tài)比較（HE，×40）

2.4 各組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血湯組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平均升高（P＜0.05）；與補腎活血湯組比較，補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平均降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清OPN、ALP、OCN 水平比較（）

表2 各組大鼠血清OPN、ALP、OCN 水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血湯組比較，cP＜0.05

2.5 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血湯組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量明顯增加（P＜0.05）；與補腎活血湯組比較，補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量減少（P＜0.05）。（見圖3、表3）

表3 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN 蛋白相對表量達比較（）

表3 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN 蛋白相對表量達比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血湯組比較，cP＜0.05

圖3 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN 蛋白表達情況（免疫組化，×200）

3 討論

OPF患者由于存在骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞等基礎(chǔ)病變導致其骨折愈合難度較高。目前對于OP的治療主要采用抗骨吸收藥物和促骨形成藥物，然而存在一定的副作用。中醫(yī)學并無“骨質(zhì)疏松”的名稱，其臨床特征和病理機制與“骨痿”“骨枯”等較為接近，腎精虧虛、骨失滋養(yǎng)為其發(fā)病的原因，應(yīng)從補腎強骨治療[11]。中醫(yī)認為骨折愈合的過程涉及瘀去、生新和骨合，對骨折的治療應(yīng)從活血逐瘀、接筋續(xù)骨、滋腎補血等多方面結(jié)合進行[12]。補腎活血湯最早記錄于《傷科大成》，具有益腎補精、強骨益髓、活血逐痛等功效，為臨床治療骨折的常用方劑，可同時滿足骨質(zhì)疏松和骨折的治療思路。臨床研究顯示[13]，補腎活血湯可增加OPF患者術(shù)后骨密度，提高其骨礦物質(zhì)含量，促進骨折愈合。體內(nèi)和體外研究顯示[9,14]，補腎活血湯可激活Runt轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor2，Runx2）及轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達，促進骨髓MSCs成骨分化及OPF大鼠骨折愈合。本研究觀察到，經(jīng)補腎活血湯治療的OPF大鼠骨折線模糊，出現(xiàn)大量骨痂，與既往研究一致。并且補腎活血湯可明顯提高骨體積分數(shù)、骨密度、骨小梁數(shù)量，改善骨微結(jié)構(gòu)，增加骨組織的生物應(yīng)力，促進骨組織新生，增加血清中成骨因子水平，表明補腎活血湯可促進成骨形成，加速OPF大鼠骨折愈合過程。

炎癥細胞、MSCs等細胞募集、遷移和歸巢至骨折部位對于炎癥過程、新血管及軟骨形成、成骨和骨愈合至關(guān)重要，趨化因子等為上述細胞遷移過程中的主要調(diào)節(jié)劑[15]。SDF-1α為趨化因子CXC亞家族的一員，由骨髓基質(zhì)細胞分泌，在血管生成和細胞歸巢中起主要作用，CXCR4廣泛分布在MSCs和骨髓基質(zhì)細胞的表面，為SDF-1α的受體[16]。缺血性組織損傷處SDF-1α表達迅速上調(diào)，可招募循環(huán)中攜帶CXCR4的MSCs，并將其招募至損傷部位，進而協(xié)助組織修復(fù)[17]。另有研究指出，糖尿病骨折大鼠骨折部位SDF-1α和CXCR4表達降低，與骨折愈合不良有關(guān)[18]。SDF-1α/CXCR4通路可能在骨骼再生中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量低于對照組，可能是其骨折愈合不良的原因。SDF-1α和成骨基因在牽引成骨區(qū)的表達顯著增高，SDF-1α/CXCR4信號拮抗劑則可顯著抑制牽引成骨中的骨礦化和新骨形成[10]，而過表達CXCR4可提高OP大鼠骨密度，增加骨形成[19]。熊云譜等[20]發(fā)現(xiàn)補腎活血湯含藥血清可促進骨髓MSCs的遷移，并可上調(diào)CXCR4蛋白表達。本研究中，補腎活血湯治療后OPF大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量明顯升高，表明補腎活血湯可促進骨組織SDF-1α/CXCR4通路活化，而SDF-1α和CXCR4相互作用可誘導MSCs等向骨折處遷移并分化為成骨細胞，促進骨形成，加速骨折愈合[21]。另外，采用SDF-1α/CXCR4通路拮抗劑AMD3100干預(yù)后，補腎活血湯對OPF大鼠骨折愈合的改善作用被AMD3100逆轉(zhuǎn)，進一步表明補腎活血湯可能通過激活SDF-1α/CXCR4通路，誘導MSCs向骨折處遷移，促進骨形成，加速骨折愈合。

綜上所述，補腎活血湯可能通過激活SDF-1α/CXCR4通路，誘導BMSCs向骨折處遷移，促進骨形成，加速OPF大鼠骨折愈合。然而中藥多同時作用于多靶點，補腎活血湯對OPF愈合的促進作用可能涉及其他機制，有待進一步研究。