夏士濤，王培宇，張開創(chuàng)，魏 靜

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

慢性硬膜下血腫（chronic subdural hematomas，CSDH）常見于老年群體。隨著老齡化社會(huì)結(jié)構(gòu)的發(fā)展，接受介入手術(shù)的老年患者日益增加，抗凝藥物、抗血小板藥物的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致CSDH發(fā)病率逐年上升[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，CSDH血腫吸收速度與血腫包膜血管新生具有緊密聯(lián)系，而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascularendoth elial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等血管生成相關(guān)因子與該病預(yù)后同樣密切相關(guān)。海風(fēng)藤是胡椒科植物風(fēng)藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤莖，具有通經(jīng)絡(luò)、祛風(fēng)濕的功效，主要用于風(fēng)寒濕痹、筋脈拘攣、屈伸不利的治療。有報(bào)道顯示[4]，海風(fēng)藤提取物可通過減輕氧化應(yīng)激、減少神經(jīng)元凋亡改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦損傷，提示其具有神經(jīng)功能保護(hù)作用。但目前有關(guān)海風(fēng)藤醇提取物對(duì)CSDH治療作用的研究尚少。本研究通過建立CSDH大鼠模型，觀察海風(fēng)藤醇提取物對(duì)血管新生及VEGF、bFGF表達(dá)的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（370±20）g，購自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0007。所有大鼠健康狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)前于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，溫度（24±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，12 h/12 h明暗交替。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 海風(fēng)藤醇提取物（批號(hào)：1073-06-9，純度＞98%）購自西安青芷生物技術(shù)有限公司，使用前與DMSO混合，配制成質(zhì)量濃度為1、5、10 μg/mL的溶液；免疫組織化學(xué)染色試劑盒（上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：BJ-15041）；HE染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：ZN1970）；兔抗大鼠CD31一抗（批號(hào)：ab28364）、兔抗大鼠VEGF一抗（批號(hào)：ab32152）、兔抗大鼠bFGF一抗（批號(hào)：ab208687）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 ALC-H型大鼠電動(dòng)腦立體定向儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）；微量注射泵（淮北軟隆生物科技有限公司）；MacroMR型小動(dòng)物核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）成像儀（蘇州紐邁分析儀器股份有限公司）；H7500型電子顯微鏡（日本株式會(huì)社日立制作所）；iBright Imager型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模與分組[5]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始建模。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，以立體定向儀固定于操作臺(tái)，頭頂部正中垂直切口，長(zhǎng)度5 mm，采用楔形高速鉆頭在矢狀縫及冠狀縫左側(cè)3 mm位置鉆一個(gè)直徑為0.9 mm的骨窗。顯微鏡下采用1 mL空針針尖將尚未完全磨開的硬腦膜分離。采用無菌注射器采集大鼠尾靜脈靜脈血600 μL，調(diào)整立體定向儀使注射器前端錐形開口在下降時(shí)可恰好嵌頓于骨窗，啟動(dòng)微量注射泵，以30 μL/min的速度緩慢向硬膜下隙注射非抗凝自體血液300 μL，全部注入硬膜下腔后，調(diào)整速度為10 μL/min注射10 min，防止迅速注血引發(fā)顱內(nèi)壓急劇升高或急性腦損傷，兩個(gè)階段注血共計(jì)400 μL。血凝后將注血針拔除，縫合切口，常規(guī)消毒。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：建模后3、10、17、24 d采用3.0 T MRI掃描檢測(cè)大鼠頭部，如首次注血后第3天急性期血腫在T2WI序列圖像上呈現(xiàn)為位于額頂顳葉及硬腦膜之間的橢圓形高信號(hào)影像，且后續(xù)掃描無嚴(yán)重挫裂傷、血腫突破、重度腦水腫表示建模成功。10只大鼠僅開骨窗、縫合，作為假手術(shù)組。50只大鼠建立CSDH模型，3只死亡，40只建模成功，將建模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 建模后24 d確認(rèn)建模成功后開始給藥。低、中、高劑量組大鼠分別按照1 mL/100 g腹腔注射質(zhì)量濃度為1、5、10 μg/mL的海風(fēng)藤醇提取物DMSO溶液，假手術(shù)組、模型組大鼠均按照1mL/100 g腹腔注射DMSO溶液。1次/d，連續(xù)給藥14d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 硬膜下血腫體積 末次給藥后次日，采用3.0 T MRI掃描檢測(cè)各組大鼠頭部，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其置于MRI掃描專用線圈中，設(shè)置為T2WI序列進(jìn)行冠狀位掃描，層厚：1 mm。選取血腫體積最大斷層截面，測(cè)量血腫縱徑、橫徑，記錄血腫層面，計(jì)算血腫體積。

1.6.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 末次給藥后次日，采用Zea Longa評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能[6]。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：對(duì)側(cè)前爪不能完全伸張；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈行走；3分：向?qū)?cè)行走傾倒；4分：意識(shí)模糊，難以站立爬行。分?jǐn)?shù)越高，提示大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.6.3 組織取材 MRI掃描及大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià)完成后，脫頸處死大鼠，剝離大鼠血腫外膜，分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，病理切片機(jī)切成4 μm厚度切片，用于免疫組化染色及HE染色，一份保存于液氮中用于Western blotting檢測(cè)。

1.6.4 硬膜新生血管密度 取硬膜組織切片，脫蠟后PBS沖洗，3%過氧化氫孵育15 min，PBS浸泡30 min。滴加枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液，微波后冷卻至40 ℃，蒸餾水沖洗。滴加山羊血清室溫下封閉15 min，棄血清。滴加兔抗大鼠CD31一抗（1∶800），濕盒中4 ℃過夜，PBS沖洗。山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），37 ℃孵育15 min，PBS沖洗。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)不相鄰視野，計(jì)算新生血管密度。

1.6.5 硬膜組織病理變化 取硬膜組織切片常規(guī)脫蠟，沖洗1 min，蘇木精染液染色5 min，沖洗，滴入1%鹽酸酒精，沖洗2 s，促藍(lán)液反藍(lán)，沖洗15 s，1%伊紅染液染色30 s，自來水沖洗，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明2次，每次3 s，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察病理變化。

1.6.6 硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白表達(dá)水平 取液氮保存的硬膜組織，RIPA裂解液裂解，BCA試劑盒定量蛋白濃度。取30 μg待測(cè)樣本上樣，沸水浴5 min，離心取上清，恒壓下經(jīng)10%SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)至膜，室溫下封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠VEGF、bFGF一抗（1∶500），4 ℃搖床孵育過夜，洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，暗室中顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，目的蛋白表達(dá)量以其條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺損；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低（P＜0.05），且具有劑量依賴性；與低劑量組比較，中劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（，n=10）

2.2 各組大鼠硬膜下血腫體積比較 與模型組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠硬膜下血腫體積明顯縮?。≒＜0.05），且呈劑量依賴性；與低劑量組比較，中劑量組大鼠硬膜下血腫體積明顯縮小（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠硬膜下血腫體積明顯縮?。≒＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠硬膜下血腫體積比較（，n=10）

2.3 各組大鼠新生血管密度比較 采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)血管標(biāo)志蛋白CD31蛋白表達(dá)，CD31蛋白標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性染色為棕黃色或棕褐色。結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組大鼠CD31蛋白表達(dá)增加；與模型組比較，低劑量組大鼠CD31蛋白表達(dá)減少；與低劑量組比較，中劑量組大鼠CD31蛋白表達(dá)減少；與中劑量組比較，高劑量組大鼠CD31蛋白表達(dá)減少。（見圖3）

圖3 各組大鼠硬膜新生血管密度比較（免疫組化，×200，標(biāo)尺50 μm）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠新生血管密度比較（）

表1 各組大鼠新生血管密度比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組大鼠硬膜組織病理變化情況 假手術(shù)組大鼠硬膜組織染色較淺，未觀察到血腫及炎癥反應(yīng)；模型組大鼠硬膜組織顏色深暗，可觀察到大量血腫，以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生；低、中劑量組大鼠硬膜組織血腫開始吸收，血腫與腦皮層間逐漸形成包膜，血腫內(nèi)可觀察到機(jī)化組織；高劑量組大鼠硬膜組織血腫被大部分吸收，內(nèi)膜與外膜間僅可觀察到薄層血腫，血腫內(nèi)可觀察到機(jī)化組織。（見圖4）

圖4 各組大鼠硬膜組織病理變化情況（HE，×100，標(biāo)尺100 μm）

2.5 各組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。（見圖5～6）

圖5 各組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖6 各組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n=10）

3 討論

CSDH是一種常見的神經(jīng)外科疾病，血腫位于硬膜下腔中，占位血腫通過壓迫腦組織導(dǎo)致其缺血、缺氧，并改變血腦屏障通透性從而引發(fā)一系列繼發(fā)性損害[7]。研究顯示[8-9]，高齡，頭部外傷，酗酒，抗凝或抗血小板治療，顱內(nèi)病損，以及顱內(nèi)壓持續(xù)降低等均是CSDH發(fā)生的常見危險(xiǎn)因素。目前，鉆孔引流術(shù)是臨床治療CSDH的主要方式，但因該病發(fā)病位置特殊且好發(fā)于老年群體，整體療效并不理想，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[10]。CSDH在中醫(yī)學(xué)中屬“頭痛”范疇，頭部創(chuàng)傷傷及腦絡(luò)，瘀血內(nèi)滯、阻滯腦絡(luò)是其主要病因，故治療應(yīng)以化瘀通絡(luò)為主[11]。海風(fēng)藤是常用的通絡(luò)藥物，其活性單體化合物在CSDH中的治療意義及機(jī)制備受關(guān)注。

血腫包膜血管新生在CSDH發(fā)展過程中具有重要作用[12]。CSDH包膜質(zhì)地厚，纖維蛋白溶酶原與新生毛細(xì)血管豐富，但因新生血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整、基膜不成熟，可反復(fù)生成與出血，并大多是畸形血管，通透性強(qiáng)，可刺激硬膜邊緣細(xì)胞持續(xù)增生并不斷形成新膜，導(dǎo)致血腫進(jìn)一步增大[13-15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、血腫外膜新生血管密度均明顯降低，血腫體積明顯縮小，且呈劑量依賴性，提示海風(fēng)藤醇提取物可促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的改善及血腫吸收，并抑制血管新生。海風(fēng)藤具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抑制血小板活化、保護(hù)局部缺血組織等藥理作用。從海風(fēng)藤中分離的醇提取物主要包括黃酮類、生物堿、木質(zhì)素類、環(huán)氧化合物、揮發(fā)油等，血小板活性因子拮抗作用極強(qiáng)，而血小板活性因子是CSDH腦損傷進(jìn)程中關(guān)鍵的病理介質(zhì)，推測(cè)海風(fēng)藤醇提取物可有效阻止CSDH病理損傷過程，促進(jìn)血腫吸收。

VEGF是目前已知的最為強(qiáng)效的血管生成促進(jìn)因子，bFGF是最為有效的血管生成因子，兩者具有明顯的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與管腔形成作用，明顯高表達(dá)于CSDH血腫腔及硬膜中，并參與血腫轉(zhuǎn)歸，可作為反映機(jī)體血管新生及修復(fù)功能的敏感指標(biāo)[16]。有報(bào)道顯示[17]，CSDH血腫壁中高VEGF表達(dá)的患者，面臨著更高的鉆孔引流術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，推測(cè)原因?yàn)槠洚惓Ｉ呖蓴_亂血腫壁功能紊亂并致其血管增生，且明顯增加微血管通透性。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，且呈劑量依賴性，提示海風(fēng)藤醇提取物對(duì)CSDH的治療作用可能通過抑制VEGF、bFGF表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，海風(fēng)藤醇提取物可改善CSDH大鼠神經(jīng)功能，抑制其血管新生，且表現(xiàn)為劑量依賴性，推測(cè)其作用機(jī)制與抑制硬膜VEGF、bFGF表達(dá)有關(guān)。海風(fēng)藤醇提取物對(duì)CSDH的作用靶點(diǎn)是否存在多途徑尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。此外，本研究未使用VEGF、bFGF激活劑對(duì)機(jī)制進(jìn)行深入探索，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中展開。