丁 越，徐曉宇，王亞非，高巖磊，沈明浩,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130000；2.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司大連分公司，遼寧大連 116601）

環(huán)磷酰胺作為抗腫瘤藥物，已在抗癌化療中得到了廣泛應(yīng)用。此外，環(huán)磷酰胺也可以作為免疫抑制劑，治療機(jī)體免疫疾病。但這類化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)具有細(xì)胞毒性作用，可以使男性睪丸生精能力受到不同程度的損害甚至導(dǎo)致不育[1]，目前認(rèn)為，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致睪丸受損傷的主要機(jī)制是由于患者睪丸氧化與抗氧化平衡被破壞，過氧化物質(zhì)損傷睪丸細(xì)胞、DNA，損傷導(dǎo)致的生殖功能受損[2?4]。對(duì)于環(huán)磷酰胺對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷引起了大家的廣泛關(guān)注。尋找天然植物中安全無副作用的活性成分來預(yù)防和改善由藥物導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)損傷已成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

淫羊藿（Epimedium），多年生宿根性草本植物，在我國有多年的藥用歷史。近年來研究表明淫羊藿中存在多種活性物質(zhì)[5?6]，具有抗氧化、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)免功能、保護(hù)生殖系統(tǒng)等生理活性[7?11]，而國家衛(wèi)生部將淫羊藿作為補(bǔ)益藥物以來，淫羊藿在保健品中得到了廣泛的應(yīng)用，現(xiàn)已開發(fā)出了淫羊藿復(fù)合膠囊、勁酒等。淫羊藿主要的生理活性之一是對(duì)生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用。已有報(bào)道，淫羊藿提取物可以提升精子的能量代謝水平、提高受損傷小鼠精子質(zhì)量、精子密度和精子活率、改善受損傷小鼠睪丸組織的病變[12?14]。研究表明，多種生物堿類物質(zhì)已被證實(shí)可以有效保護(hù)藥物導(dǎo)致的小鼠生殖系統(tǒng)損傷[13,15]，但由于部分生物堿具有較強(qiáng)生物毒性，沒有得到廣泛應(yīng)用。近年來對(duì)淫羊藿生物堿保護(hù)生殖系統(tǒng)作用的研究還處于空白階段。尤其是對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)機(jī)制的研究還未見報(bào)道。

本研究在探討淫羊藿生物堿是否具有生殖毒性的基礎(chǔ)上，深入研究淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)機(jī)制。此研究為探索淫羊藿資源新的生理活性提供了科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取SPF 級(jí)雄性昆明種8 周齡小鼠80 只（體質(zhì)量 18～20 g） 遼寧長生生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)SCXK（遼）2020-0001）；淫羊藿葉 采摘于吉林省通化地區(qū)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院李大軍教授鑒定為朝鮮淫羊藿；環(huán)磷酰胺 上海萌椏生物科技有限公司；伊紅 天津市光復(fù)化工研究所；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、睪酮、蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

XPR-205 電子分析天平 梅特勒-超越系列；HWS-1200CO2培養(yǎng)箱 南京天翔公司；FB-1B-80凍干機(jī) 上海爭巧科學(xué)儀器有限公司；FW-1200 電泳儀、電泳槽 北京六一儀器廠；Varioskan-LUX 全自動(dòng)酶標(biāo)儀、KN-01 多功能凝膠成像分析儀 康恒儀器有限公司；KL-01A 離心機(jī) 江蘇凱達(dá)公司；VK-X 光學(xué)顯微鏡 基恩士公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淫羊藿生物堿的制備 參照張龍[2]對(duì)淫羊藿生物堿的提取的方法，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合超聲法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取10.0 g 淫羊藿葉粉末，然后加入 300 mL pH=1 的體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇溶液浸泡20 min，抽濾獲得濾液，然后于超聲清洗儀器在超聲功率為200 W，溫度40 ℃，提取40 min，抽濾，棄濾渣合并濾液，濾液減壓回收乙醇得到酸水液10 mL，重復(fù)3 次，取酸水層加入100 mL 10%的NaOH調(diào)節(jié)pH 至10～11，分裝于50 mL離心管中，在 5 ℃，6000 r/min 的條件下離心10 min 得沉淀，用10%NaOH的溶液洗滌并離心三次，棄上清液，加入pH1 的90%酸性乙醇溶液20 mL，超聲溶解后經(jīng)氯仿萃取后抽濾得上清液。冷凍干燥，得粗生物堿，提取得到生物堿得率為9.72%，用三氯甲烷硅膠柱層析法純化后[16]，純度為71.52%，以此條件制得的生物堿用于后續(xù)研究。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 首先取40 只SPF 級(jí)昆明種雄性小鼠（動(dòng)物飼養(yǎng)溫度22 ～25 ℃、濕度50%～60%，光照/黑各12 h），根據(jù)韋賢等[13]實(shí)驗(yàn)方法確定小鼠給藥劑量和分組情況。小鼠分為空白組、淫羊藿生物堿低（50 mg/kg）、中（100 mg/kg）、高（200 mg/kg）劑量組，每組10 只；再取40 只昆明種雄性小鼠，分為環(huán)磷酰胺組（40 mg/kg）、環(huán)磷酰胺-生物堿低、中、高劑量組，每組10 只。處理方法如下：空白組（與之前分組共用一組空白組）、淫羊藿生物堿低、中、高劑量組連續(xù)5 d 注射生理鹽水，末次注射24 h 后，生物堿低、中、高劑量組進(jìn)行灌胃給藥30 d，空白組灌胃同等體積生理鹽水。環(huán)磷酰胺組與環(huán)磷酰胺-生物堿低、中、高劑量組連續(xù)5 d 注射環(huán)磷酰胺。末次注射24 h 后，環(huán)磷酰胺-生物堿低、中、高劑量組灌胃給藥生物堿30 d，環(huán)磷酰胺組灌胃同等體積生理鹽水。

1.2.3 小鼠體重、睪丸和附睪系數(shù)的測定 實(shí)驗(yàn)期間，每周對(duì)各組小鼠稱重記錄。第30 d，處死各組小鼠，分離附睪和睪丸并稱重，計(jì)算其睪丸、附睪系數(shù)。

1.2.4 小鼠精子質(zhì)量的測定

1.2.4.1 小鼠精子密度的測定 取小鼠雙側(cè)附睪，放入培養(yǎng)皿中，加入 2 mL 0.9%生理鹽水，在培養(yǎng)皿中挑破附睪并輕輕擠壓，使精子游離在生理鹽水中。將附睪取出丟棄。將培養(yǎng)皿置于37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育5 min 制成精子懸液，用移液槍取20 μL 精子懸液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下觀察并用白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行精子計(jì)數(shù)[16]（精子密度）。

1.2.4.2 小鼠精子活力的測定 取1.2.4.1 的精子懸液20 μL 滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。在光學(xué)顯微鏡下觀察200 個(gè)精子，計(jì)算小鼠精子活力。精子活力可分為4 個(gè)等級(jí)：1 級(jí)：精子快速直線運(yùn)動(dòng)。2 級(jí)：精子波浪性或慢速直線運(yùn)動(dòng)。3 級(jí)：精子運(yùn)動(dòng)方向不明確，呈徘徊或轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)。4 級(jí)：精子沒有運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。通過各級(jí)精子的數(shù)量考察精子活力[13]。

1.2.4.3 小鼠精子存活率的測定 取1.2.4.1 的精子懸液20 μL，滴于載玻片上，推片使其均勻，置于甲醇染缸中固定5 min，取出晾干后，放入含有2.5%伊紅的染缸中進(jìn)行染色10 min，染色完畢后，染色劑沖洗干凈后晾干置于光學(xué)顯微鏡下觀察精子著色情況。染為紅色的精子為死亡精子，不著色的精子為活精子。隨機(jī)選取載玻片的一個(gè)區(qū)域，計(jì)算500 個(gè)精子的存活率。

1.2.4.4 小鼠精子畸形率的測定 用1.2.4.3 的方法重新制片染色觀察500 個(gè)精子，記錄畸形精子的數(shù)量計(jì)算小鼠精子畸形率。其中無頭、無尾、雙頭、雙尾、香蕉型、無定型精子記為畸形精子。

1.2.5 小鼠睪丸組織中SOD 活力和MDA 含量的測定 取各組小鼠睪丸，研磨成10%的組織勻漿。倒入10 mL 的EP 管中，在4 ℃ 3000 r/min 的離心機(jī)中離心10 min，取上清。根據(jù)試劑盒說明測定小鼠睪丸組織中SOD 活力和MDA 含量。

1.2.6 小鼠血清中睪酮的測定 對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼球取血放入2 mL 的EP 管中。在4 ℃ 3000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，取上清。根據(jù)試劑盒說明測定小鼠血清中睪酮含量。

1.2.7 小鼠睪丸組織中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的檢測 取睪丸組織，按照1:5 的體積加入RIPA 裂解液，使用組織研磨儀將睪丸研碎并置于冰上繼續(xù)裂解30 min，于4 ℃ 5000 r/min 離心10 min，取其上清，參照Braford 法[17]檢測睪丸中Bax 和Bcl-2 的蛋白濃度。上清液按照1:5 的比例加入緩沖液，在沸水浴中煮10 min 使蛋白變性。每個(gè)孔加入20 μL蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后使用多功能凝膠成像分析儀進(jìn)行成像。

1.2.8 小鼠睪丸組織病理學(xué)觀察 取小鼠單側(cè)睪丸，制作石蠟切片，HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠睪丸組織病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均以±SD（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析時(shí)均采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿生物堿對(duì)小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)期間小鼠生長狀態(tài)良好。體重變化情況見表1，與空白組小鼠比較，生物堿低、中、高劑量組連續(xù)灌胃后，各組小鼠體重變化不顯著（P>0.05），說明淫羊藿生物堿對(duì)小鼠體重沒有影響。而環(huán)磷酰胺組小鼠體重極顯著下降（P<0.01）。與環(huán)磷酰胺組比較，環(huán)磷酰胺-生物堿低、中、高劑量小鼠體重均維持在正常水平，其中環(huán)磷酰胺-生物堿低劑量組與環(huán)磷酰胺組比較，體重顯著變化（P<0.05），環(huán)磷酰胺-生物堿中、高劑量組體重變化極顯著（P<0.01）。說明淫羊藿生物堿可以有效緩解由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠體重下降。

表1 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠體重的影響（g）Table 1 Effects of Epimedium alkaloids on weight of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide（g）

2.2 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺致生殖系統(tǒng)損傷睪丸、附睪系數(shù)影響

睪丸、附睪系數(shù)數(shù)變化情況見表2，與空白組小鼠比較，淫羊藿生物堿連續(xù)灌胃30 d 的小鼠睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)沒有顯著變化（P>0.05），說明淫羊藿生物堿對(duì)小鼠睪丸和附睪的系數(shù)沒有影響。而環(huán)磷酰胺組小鼠睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)相比于空白組小鼠變化有極顯著性差異（P<0.01），小鼠睪丸系數(shù)下降了26.9%，小鼠附睪系數(shù)下降了25.8%。與環(huán)磷酰胺組小鼠比較，環(huán)磷酰胺-生物堿低劑量組小鼠連續(xù)灌胃30 d 后，睪丸和附睪系數(shù)均有顯著提高（P<0.05），分別提高15.1%和3.2%。環(huán)磷酰胺-生物堿中、高劑量組小鼠連續(xù)灌胃30 d 后，睪丸和附睪系數(shù)均有顯著提高（P<0.05）。睪丸系數(shù)分別提高了28.5%、35.0%。附睪系數(shù)分別提高了14.7%、25.8%。

表2 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸、附睪系數(shù)的影響（%）Table 2 Effects of Epimedium alkaloids on testicular and epididymis coefficient of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide（%）

2.3 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠精子質(zhì)量的影響

小鼠精子質(zhì)量變化情況見表3，與空白組小鼠比較，淫羊藿低、中、高劑量組灌胃后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率、精子畸形率的變化并沒有顯著性差異（P>0.05），說明淫羊藿生物堿對(duì)小鼠精子沒有造成損傷。小鼠注射環(huán)磷酰胺后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率分別極顯著下降了59.8%、31.5%、45.9%（P<0.01），精子畸形率極顯著升高了905%（P<0.01）。與環(huán)磷酰胺組小鼠比較，環(huán)磷酰胺-生物堿低劑量組灌胃后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率分別提高了33.8%、15.4%、26.0%，精子畸形率下降了60.9%（P<0.05），而環(huán)磷酰胺-生物堿中、高劑量組灌胃后，小鼠精子密度、精子活力、精子存活率、精子畸形率的變化有極顯著性差異（P<0.01）。小鼠精子密度分別提高了59.0%、84.2%，小鼠精子活力分別提高24.6%、37.6%，精子存活率分別提高了34.7%、53.8%，而精子畸形率分別降低了68.4%、71.7%。

表3 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠精子質(zhì)量的影響Table 3 Effects of Epimedium alkaloid on sperm quality of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.4 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸組織中SOD 活力和MDA 含量的影響

SOD 變化情況由圖1 可知，與空白組比較，淫羊藿生物堿低、中、高劑量組灌胃30 d 后，小鼠睪丸組織中SOD 的活性變化沒有顯著性差異（P>0.05），說明淫羊藿生物堿不會(huì)影響小鼠SOD 的活性。小鼠注射環(huán)磷酰胺后睪丸組織中SOD 的活性極顯著下降40.6%（P<0.01）。與環(huán)磷酰胺組小鼠比較，環(huán)磷酰胺-生物堿低、中、高組小鼠連續(xù)灌胃30 d 后，環(huán)磷酰胺-生物堿低劑量組SOD 的活性顯著提高12.6%（P<0.05），環(huán)磷酰胺-生物堿中、高劑量組小鼠睪丸組織中SOD 的活性極顯著提高26.1%、35.4%（P<0.01）。

圖1 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸組織中SOD 活力的影響Fig.1 Effect of Epimedium alkaloid on SOD activity in testis of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

由圖2 可知，與空白組比較，淫羊藿生物堿低、中、高劑量組灌胃30 d 后，小鼠睪丸組織中MDA 的含量變化沒有顯著性差異（P>0.05），說明淫羊藿生物堿不會(huì)影響小鼠MDA 的含量。與空白組小鼠比較，小鼠注射環(huán)磷酰胺后睪丸組織MDA 的含量極顯著升高了57.6%（P<0.01）。與環(huán)磷酰胺組比較，環(huán)磷酰胺-生物堿低劑量組MDA 的含量顯著下降14.3%（P<0.05）、環(huán)磷酰胺-生物堿中、高組小鼠MDA 的含量極顯著下降29.5%、31.6%（P<0.01）。

圖2 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸組織中MDA 含量的影響Fig.2 Effect of Epimedium alkaloid on MDA activity in testis of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.5 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠血清中睪酮含量的影響

由圖3 可知，與空白組比較，淫羊藿生物堿低、中、高劑量組灌胃30 d 后，小鼠血清中睪酮的含量變化沒有顯著性差異（P>0.05），說明淫羊藿生物堿不會(huì)影響小鼠血清中睪酮的含量。小鼠注射環(huán)磷酰胺后血清中睪酮的含量與空白組比較極顯著降低了60.4%（P<0.01）。與環(huán)磷酰胺組小鼠比較，環(huán)磷酰胺-淫羊藿生物堿低劑量組睪酮含量顯著升高24.6%（P<0.05），環(huán)磷酰胺-生物堿中、高組小鼠灌胃30 d后小鼠血清中睪酮的含量極顯著升高了49.4%、54.4%（P<0.01）。

圖3 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠血清中睪酮的影響Fig.3 Effect of Epimedium alkaloid on testosterone in serum of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.6 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸組織中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

由圖4 可知，與空白對(duì)照組比較，淫羊藿生物堿低、中、高劑量組Bcl-2/Bax 的比值無顯著差異（P>0.05），說明淫羊藿生物堿不會(huì)促進(jìn)睪丸組織細(xì)胞凋亡。與空白對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組Bcl-2/Bax 的比值極顯著下降（P<0.01），該結(jié)果說明環(huán)磷酰胺會(huì)促進(jìn)睪丸組織的凋亡，導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡。與環(huán)磷酰胺組小鼠相比較，環(huán)磷酰胺-淫羊藿生物堿低劑量組，Bcl-2/Bax 的比值有顯著提高（P<0.05），環(huán)磷酰胺-淫羊藿生物堿中、高劑量組小鼠Bcl-2/Bax 的比值有極顯著提高（P<0.01）。

圖4 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸組織中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Epimedium alkaloid on expression of Bax and Bcl-2 proteins in testicular tissue of male mice with reproductive system injury induced by cyclophosphamide

2.7 淫羊藿生物堿對(duì)環(huán)磷酰胺生殖系統(tǒng)損傷小鼠睪丸組織病理學(xué)觀察

通過對(duì)小鼠睪丸組織切片觀察，空白組小鼠睪丸組織中生精細(xì)胞排列整齊數(shù)量眾多，并且形態(tài)完整，睪丸間質(zhì)細(xì)胞管腔內(nèi)充滿眾多的新生精子（圖5A）。小鼠連續(xù)灌胃淫羊藿生物堿低、中、高劑量30 d 后，睪丸組織形態(tài)與空白組相似，無明顯病理學(xué)變化（圖5B、C、D）。通過切片觀察，環(huán)磷酰胺組小鼠睪丸組織中生精細(xì)胞數(shù)量減少，管腔內(nèi)幾乎沒有新生精子，睪丸組織受到嚴(yán)重?fù)p傷（圖5E）。與環(huán)磷酰胺組小鼠比較，環(huán)磷酰胺-生物堿低劑量組的小鼠睪丸組織中生精細(xì)胞和管腔內(nèi)新生精子的數(shù)量有所增加（圖5F）。環(huán)磷酰胺-生物堿中劑量組的小鼠生精細(xì)胞數(shù)量更多，管腔內(nèi)新生精子的數(shù)量也有少量增加，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量也有明顯增加（圖5G）。環(huán)磷酰胺-生物堿高劑量組小鼠睪丸組織中間質(zhì)細(xì)胞更加完整，生精細(xì)胞與管腔內(nèi)新生精子數(shù)量也明顯增加（圖5H）。

圖5 小鼠睪丸形態(tài)學(xué)分析Fig.5 Morphological analysis of mouse testis

3 討論與結(jié)論

生殖系統(tǒng)對(duì)化學(xué)毒物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還未出現(xiàn)毒性反應(yīng)之前，生殖系統(tǒng)可能已受損害[18]。環(huán)磷酰胺能夠損傷小鼠精子質(zhì)量，使精子活力下降，睪丸結(jié)構(gòu)發(fā)生病變[19]。精子質(zhì)量及活力可反映該藥物的生殖毒性和對(duì)生殖細(xì)胞潛在的致突變性。環(huán)磷酰胺在造成生精損傷的同時(shí)，也可破壞睪丸組織內(nèi)氧化與抗氧化的平衡系統(tǒng)，降低睪丸組織的抗氧化能力，導(dǎo)致氧自由基及其過氧化物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)大量累積，從而造成睪丸組織氧化應(yīng)激損傷。SOD 能清除超氧陰離子自由基，可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基的攻擊，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[10]。MDA 可分解由自由基攻擊機(jī)體生物膜而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是常用的評(píng)定機(jī)體氧化損傷的指標(biāo)[20]。MDA 水平可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。因此，聯(lián)合檢測組織中SOD、MDA 含量，能確切地反映組織抗氧化能力和氧化應(yīng)激損傷程度[17]。

本研究結(jié)果表明，淫羊藿生物堿對(duì)雄性小鼠的生殖系統(tǒng)無生殖毒性作用。利用環(huán)磷酰胺造模后發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可致睪丸、附睪質(zhì)量減輕、精子密度降低、精子畸形率升高、睪丸組織抗氧化酶SOD 的含量下降，過氧化產(chǎn)物MDA 含量明顯升高，說明環(huán)磷酰胺成功造成小鼠生精損傷及睪丸組織氧化應(yīng)激損傷，這與潘曉燕等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。給予淫羊藿生物堿可使小鼠精子密度、活力和存活率顯著提高（P<0.05）、精子畸形率顯著下降（P<0.05），說明淫羊藿生物堿可以改善模型小鼠的生精損傷，且當(dāng)給予由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)損傷小鼠一定劑量的淫羊藿生物堿后，睪丸組織內(nèi)抗氧化能力明顯升高，組織損傷得到了修復(fù)。說明淫羊藿生物堿在一定程度上可通過緩解氧化損傷來保護(hù)生殖系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)環(huán)磷酰胺引起的雄性生殖系統(tǒng)損傷起到了保護(hù)作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)淫羊藿生物堿可提高小鼠血清中睪酮的含量。在哺乳動(dòng)物中睪酮的含量與精子的生成密不可分[21?23]。睪酮的合成量直接關(guān)系到精子的數(shù)量和質(zhì)量，所以說睪酮含量的高低是保證精液品質(zhì)的重要因素[24?26]。環(huán)磷酰胺注射后小鼠血清睪酮含量降低，而通過淫羊藿生物堿進(jìn)行灌胃后的小鼠睪酮含量明顯升高，進(jìn)而提高了雄性小鼠的生殖功能，對(duì)生殖系統(tǒng)起到了一定的保護(hù)作用[27?28]。最后，考察了生物堿對(duì)抑制睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響。精子凋亡蛋白是判斷精子質(zhì)量的重要指標(biāo)。Bcl-2 是凋亡抑制蛋白，Bax 是促細(xì)胞凋亡蛋白，Bcl-2/Bax 的比值可以反映灌胃淫羊藿生物堿后細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后是趨向于凋亡或存活情況。環(huán)磷酰胺注射后小鼠睪丸組織中Bcl-2/Bax 的比值降低，淫羊藿生物堿進(jìn)行灌胃后，Bcl-2/Bax 的比值極顯著升高，促進(jìn)了Bcl-2 表達(dá)，抑制了Bax 表達(dá)，睪丸細(xì)胞趨于存活狀態(tài)，進(jìn)而緩解了環(huán)磷酰胺對(duì)睪丸組織造成的損傷。

綜上所述，淫羊藿生物堿無雄性生殖毒性，且淫羊藿生物堿可通過抗氧化、升高睪酮含量、抑制睪丸組織細(xì)胞凋亡等機(jī)制，有效保護(hù)了由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的雄性小鼠生殖系統(tǒng)的損傷，可作為保護(hù)生殖系統(tǒng)的保健品原料進(jìn)行開發(fā)和推廣。