王新宇，谷 秀，位正鵬，王 鵬，李銀平，閆鳴艷，劉瑞志,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；3.海洋功能食品國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東榮成 264309；4.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042）

我國是水產(chǎn)品捕撈和加工大國，每年都有數(shù)以萬噸的水產(chǎn)品出口海外，2019 年我國水產(chǎn)品出口額占農(nóng)產(chǎn)品出口總額比重達30%，其中金槍魚出口又占據(jù)了重要的地位，因為魚肉罐頭受到各國人民的喜愛，在國外十分暢銷。蒸煮液是金槍魚罐頭加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，富含大量蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸等營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)[1]。由于加工技術(shù)的限制導(dǎo)致蒸煮液大量流失，不僅造成了極大的資源浪費，而且給企業(yè)污水處理增加了成本[2]。因此，對金槍魚蒸煮液的高值化利用是金槍魚加工企業(yè)亟待解決的問題。

目前，國內(nèi)對金槍魚蒸煮液在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究不多。楊小克等[3]、何鍵東等[4]采用酶解法從金槍魚蒸煮液中提取魚油；陳啟航等[5]采用酶解蒸煮液法制備風(fēng)味海鮮調(diào)味汁；李可欣等[6]以金槍魚蒸煮汁為原料研制金槍魚風(fēng)味沙拉醬。然而研究發(fā)現(xiàn)酶解法不易消除其固有的腥味[7?8]，酵母是一種天然發(fā)酵劑[9]，具有較好的脫腥效果[10?11]和重金屬離子吸附作用[12]，目前已有一些研究將活性干酵母應(yīng)用到海鱸魚片、草魚、牡蠣酶解液、鱘魚肉等脫腥工藝上[13?16]。本文以金槍魚蒸煮液為原料，加入酵母進行發(fā)酵制備海鮮調(diào)味品基料，通過響應(yīng)面設(shè)計確定最佳發(fā)酵工藝，對最優(yōu)條件下的發(fā)酵液進行氨基酸組成分析，以期為金槍魚蒸煮液的深度加工利用以及調(diào)味品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚蒸煮液 浙江省舟山市某金槍魚罐頭加工企業(yè)；無水乙醇、乙酸、無水乙酸鈉、甲醇、乙酰丙酮等 均為分析純；活性干酵母：黃酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、復(fù)合功能菌酵母 安琪酵母股份有限公司；面包酵母 樂斯福有限公司；71B 酵母 曼森商貿(mào)有限公司。

AR224CN 電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；CT14RDⅡ高速臺式冷凍離心機 上海天美科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；智能恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津歐諾儀器股份有限公司；PEN 3 型電子鼻 德國Airsense公司；L-8900 全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 本實驗選用感官評定、電子鼻分析、氨基酸態(tài)氮含量三項指標(biāo)來評估酵母種類、酵母添加量、時間、鹽度對發(fā)酵的影響。感官評定可以較為直觀地反映人對不同條件發(fā)酵液的接受程度[17]，電子鼻主要通過氣味指紋信息對氣體或揮發(fā)性成分做定性或定量的檢測[18?19]，可對感官評定結(jié)果進行驗證，氨基酸態(tài)氮含量的高低表示游離氨基酸的豐富程度，也可在一定程度上反應(yīng)物質(zhì)風(fēng)味特點[20?21]。

1.2.1.1 酵母種類 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發(fā)酵液，按2‰的添加量加入黃酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、71B 酵母、面包酵母、復(fù)合功能菌酵母，置于35 ℃條件下反應(yīng)12 h，隨后進行感官評定、氨基酸態(tài)氮測定、電子鼻分析。

1.2.1.2 酵母添加量 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發(fā)酵液，按不同的添加量（w/v，2‰、4‰、6‰、8‰）加入71B 酵母，置于35 ℃條件下反應(yīng)12 h，隨后進行感官評定、氨基酸態(tài)氮測定、電子鼻分析。

1.2.1.3 發(fā)酵時間 分別取30 mL 鹽度為0.20 mol/L的待發(fā)酵液，按4‰的添加量加入71B 酵母，置于35 ℃條件下分別發(fā)酵6、12、18 h（預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵24 h 和36 h 后，發(fā)酵液呈現(xiàn)明顯的硫化氫臭味，故未對該時間發(fā)酵液進行其他指標(biāo)測定），隨后進行感官評定、氨基酸態(tài)氮測定、電子鼻分析。

1.2.1.4 鹽度 分別取30 mL 不同鹽度（0.15、0.25、0.35、0.45 mol/L）的待發(fā)酵液，按4‰的添加量加入71B 酵母，置于35 ℃條件下反應(yīng)12 h，隨后進行感官評定、氨基酸態(tài)氮測定、電子鼻分析。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以感官評分為評價指標(biāo)，選取酵母添加量、發(fā)酵時間、鹽度3 個因素進行Box-Behnken 設(shè)計，各因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Response surface design

1.2.3 感官評定 參考靳艷芬等[22]對鮑復(fù)合調(diào)味品的感官評定方法，由10 位評價人員組成評價小組對樣品進行感官評定，評定采用1～10 分制，取10 名評價人員的平均分數(shù)為最終結(jié)果。感官評分參照調(diào)味料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以總體可接受度為最終評價結(jié)果，從產(chǎn)品色澤、香氣、滋味（權(quán)重比為3:4:3）進行感官評定，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards

1.2.4 電子鼻分析 參考吳靖娜[23]的方法并做適當(dāng)修改，電子鼻傳感器陣列由10 個金屬氧化物傳感器組成：1 號傳感器W1C 對芳香成分靈敏；2 號傳感器W5S 對氮氧化合物很靈敏；3 號傳感器W3C 對氨水、芳香成分靈敏；4 號傳感器W6S 對氫氣有選擇性；5 號傳感器W5C 對烷烴芳香成分靈敏；6 號傳感器W1S 對甲烷靈敏；7 號傳感器W1W 對硫化物靈敏；8 號傳感器W2S 對乙醇靈敏；9 號傳感器W2W 對芳香成分、有機硫化物靈敏；10 號傳感器W3S 對烷烴靈敏。

測定條件為：傳感器清洗時間100 s，歸零時間10 s，樣品準(zhǔn)備時間5 s，樣品測試時間150 s，內(nèi)部流量300 mL/min。選取測定過程中144～146 s 的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.2.5 氨基酸態(tài)氮含量測定 氨基酸態(tài)氮含量參考GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[24]第二法測定。

氨基酸態(tài)氮增量采用式（1）計算：

其中，Y 為氨基酸態(tài)氮增量，A1為發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量，A0為發(fā)酵液初始氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.6 氨基酸組成分析 氨基酸組成參考GB/T 5009.124-2016《食物中氨基酸的測定》[25]，使用氨基酸分析儀進行測定。

1.3 統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個實驗平行3 次。采用Excel 和Design Expert 8 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，利用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酵母種類對發(fā)酵的影響 由圖1A 可知，71B 酵母發(fā)酵后體系感官評分最高，結(jié)合電子鼻分析可知，71B 酵母對傳感器2、6 的響應(yīng)值較小，說明經(jīng)71B 酵母發(fā)酵后，發(fā)酵液中氮氧化合物和甲烷含量較低，從而呈現(xiàn)較好的風(fēng)味。雖然黃酒酵母和啤酒酵母發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量較高，但在發(fā)酵過程中也產(chǎn)生了乙醇，使得感官評分較低。因此，選擇71B 酵母用于后續(xù)發(fā)酵，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

圖1 酵母種類對發(fā)酵的影響Fig.1 The effect of yeast type on fermentation

2.1.2 酵母添加量對發(fā)酵的影響 由圖2A 可知，酵母添加量為4‰時，感官評分最高，添加量超過4‰后，感官評分呈現(xiàn)下降趨勢，可能因為酵母濃度的增加，引起微生物的競爭性抑制，減緩了腥味物質(zhì)的分解[11]。結(jié)合圖2B，酵母添加量為4‰的發(fā)酵液對傳感器2、7、9 的響應(yīng)值均最小，說明發(fā)酵液中氮氧化物、硫化物最少。氨基酸態(tài)氮含量的變化與感官評分一致，在4‰時最高。

圖2 酵母添加量對發(fā)酵的影響Fig.2 The effect of added yeast on fermentation

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響 由圖3A 可知，隨發(fā)酵時間延長，體系感官評分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，結(jié)合電子鼻分析（圖3B）可知，隨發(fā)酵時間延長，體系中氮、硫化物含量非常高，呈現(xiàn)不愉悅的氣味。由圖3C 可知，發(fā)酵時間為12 h 時，氨基酸態(tài)氮含量最高。發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)逐漸被降解成肽、氨基酸和其他小分子，但發(fā)酵后期隨著降解的進行，部分小分子肽、氨基酸被繼續(xù)分解成氮氧化物，從而導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮的含量減少，感官評分降低[26]。因此，發(fā)酵時間選擇12 h 作為最優(yōu)條件。

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of fermentation time on fermentation

2.1.4 鹽度對發(fā)酵產(chǎn)物的影響 由于不同批次不同廠家的蒸煮液中含鹽量（以NaCl 計）存在差異，且鈉鹽的濃度會影響微生物的生長代謝，進而影響蛋白質(zhì)的降解[27?28]。因此，研究蒸煮液鹽度對發(fā)酵脫腥工藝的影響十分重要。由圖4 可知，鹽度為0.25 mol/L時，樣品的感官評分和氨基酸態(tài)氮增量最高，發(fā)酵效果最好。且在此條件下，體系對傳感器2、7、9 的響應(yīng)值較小。前期實驗結(jié)果表明當(dāng)蒸煮液鹽度為0.3 mol/L 和0.25 mol/L 時，其發(fā)酵液感官評分差距較小，而蒸煮液實際鹽度為0.3 mol/L，因此響應(yīng)面試驗的鹽度以0.3 mol/L 為中心點。

圖4 鹽度對發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.4 The effect of salinity on fermentation products

2.2 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 結(jié)合單因素實驗可知，氨基酸態(tài)氮含量和感官評分結(jié)果具有一定的相關(guān)性，且不同鹽度的初始氨基酸態(tài)氮含量不同，在響應(yīng)面不同設(shè)計組中不易表征，因此以感官評分為評價指標(biāo)，選擇酵母添加量、發(fā)酵時間、鹽度三因素三水平，進行Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析，以確定海鮮調(diào)味基料的最佳制備工藝條件，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 The test results of response surface

2.2.2 方差分析 由表4 可知，P=0.0014 可知模型極顯著（P<0.01），失擬項P=0.1256，差異不顯著（P>0.05），決定系數(shù)R2=0.9428。各因素對感官評分的影響依次為B（發(fā)酵時間）>C（鹽度）>A（酵母添加量）。其中，模型的極顯著因子項（P<0.01）有B、AC、B2和C2，顯著的因子項（P<0.05）為C，可知感官評分受發(fā)酵時間的影響最大。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The ANOVA results

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖是回歸方程的圖形表述，從響應(yīng)面圖中可快速找到最佳參數(shù)[29]。由圖5可知，各因素對響應(yīng)面的陡峭程度影響由大到小依次為：發(fā)酵時間>鹽度>酵母添加量，這與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)酵母添加量固定不變時（圖5A），隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液感官評分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；當(dāng)鹽度固定不變時（圖5B），酵母添加量小于4.5‰時，感官評分上升，添加量超過4.5‰時，感官評分隨即下降；當(dāng)發(fā)酵時間固定不變時（圖5C），隨著鹽度的增加，發(fā)酵液感官評分也是先上升后下降。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of the interaction of various factors

2.2.4 最佳工藝條件的預(yù)測與驗證 由Design-Expert 8.0 軟件預(yù)測得出發(fā)酵制備海鮮調(diào)味基料最優(yōu)工藝條件為：酵母添加量4.5‰，發(fā)酵時間6 h，鹽度0.26 mol/L，感官評分9.45。在修正條件下進行3 次平行驗證實驗，感官評分9.31±0.32。與理論預(yù)測值相符，說明該優(yōu)化結(jié)果可靠，可進一步利用開發(fā)為新型調(diào)味品。

2.3 氨基酸組成分析

蒸煮液經(jīng)酵母發(fā)酵后，其中一部分蛋白質(zhì)可水解為低分子肽類和氨基酸[30]。氨基酸是一種重要的呈味物質(zhì)，氨基酸組成與滋味的形成關(guān)系密切。根據(jù)氨基酸的味覺強度可大致分為鮮味、甜味、苦味和無味四大類[31]。同時氨基酸還可作為美拉德反應(yīng)的前體物質(zhì)，與糖作用生成特殊的香味物質(zhì)[32]。因此，游離氨基酸是衡量發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的一個重要指標(biāo)。

上述實驗發(fā)現(xiàn)71B 酵母發(fā)酵后發(fā)酵液的感官評分最高，這與其呈味氨基酸的變化密切相關(guān)。如表5所示，發(fā)酵后溶液中天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）等幾種呈味氨基酸的含量均有明顯上升，其中Gly 和Glu 的含量相對較高，使發(fā)酵液呈現(xiàn)柔和的甜味和較強的鮮味。此外，纈氨酸（Val）、組氨酸（His）的含量明顯下降，可能是微生物生長繁殖利用，或是與發(fā)酵體系中的還原糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致其含量降低。由于Val 和His是苦味氨基酸，所以其含量的降低也有利于發(fā)酵液呈現(xiàn)較好的風(fēng)味。

表5 發(fā)酵液中的氨基酸組成Table 5 The amino acid composition of fermentation products

3 結(jié)論

金槍魚蒸煮液發(fā)酵制備海鮮調(diào)味品基料的最佳工藝條件為：酵母71B，酵母添加量4.5‰，發(fā)酵時間6 h，鹽度0.26 mol/L，最優(yōu)條件下，感官評分9.31±0.32，與理論預(yù)測值相符。對發(fā)酵液進行氨基酸組成分析，發(fā)現(xiàn)其天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量明顯上升，纈氨酸、組氨酸含量明顯下降。研究結(jié)果表明蒸煮液經(jīng)酵母發(fā)酵后可用于制備海鮮調(diào)味品基料，并且該發(fā)酵工藝簡單，適合在產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用，從而提升金槍魚蒸煮液的附加值。