王巧貞，潘信利，楊 玲，李 菲，李 喆，黃媛林，李翠梅，黃庶識,*

（1.廣西科學院，廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007；2.廣西師范大學物理科學與技術學院，廣西桂林 541004）

褐藻膠是巨藻、墨角藻、馬尾藻和海帶等褐藻細胞壁和細胞間質中的一類水溶性酸性多糖物質，也是褐藻中含量最多的多糖，其在地球上的含量僅次于纖維素，可作為潛在的生物質能源原料。然而褐藻膠高粘、高凝膠、不易降解、難以被機體吸收利用的特點，限制了它的應用[1]，褐藻膠的降解產物海藻酸寡糖在抗腫瘤、抗凝血、抗菌、抗病毒、增強宿主免疫力、抗氧化、神經保護、腸道消化吸收、植物的生長及保鮮等方面有良好的生物活性，被廣泛應用于食品、醫(yī)療及農業(yè)等領域[2?5]。傳統(tǒng)制備褐藻膠寡糖的方法主要有物理降解法、化學降解法和生物酶解法[6]等，其中生物酶解法因其專一性高、反應條件溫和、易控制、目標產物得率高等優(yōu)點而備受關注。

褐藻膠裂解酶通過β-消除反應將褐藻膠降解為一系列不飽和的海藻酸寡糖，根據(jù)底物專一性不同將褐藻膠裂解酶分為三類：轉移性裂解1,4-α-D-甘露糖醛酸片段的裂解酶（Aly；EC4.2.2.3），專一性裂解1,4-α-L-古羅糖醛酸片段的裂解酶（Aly；EC4.2.2.11）以及兩種片段都可裂解的雙功能裂解酶[7]。褐藻膠裂解酶來源廣泛，主要來源包括藻類、動物內臟和微生物等，其中海洋微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源之一，目前的研究表明來自于海洋動物的微生物產生的裂解海藻酸鈉的酶多數(shù)為復合酶，很難分離純化，如假交替單胞菌Pseudoalteromonas elyakoviiIAM 14954 至少能產生五種不同的海藻酸鈉裂解酶，其中一個是胞外酶，四個是胞內酶[8]。現(xiàn)有大部分微生物來源的褐藻膠裂解酶依然存在著酶活力較低、作用位點單一等缺陷，造成酶解法制備海藻提取物的成本過高，且沒有統(tǒng)一的發(fā)酵工程菌及系統(tǒng)發(fā)酵條件，褐藻膠裂解酶穩(wěn)定性差，達不到工業(yè)發(fā)酵生產要求[9]，發(fā)展受限。不同來源的海藻酸鈉降解酶所獲得的產物聚合度也會有所不同，進而對寡糖的生物活性產生影響。從不同的途徑尋找和生產具有高活性的海藻酸鈉裂解酶已成為研究焦點[10]。篩選高效降解褐藻膠菌株是開發(fā)褐藻資源的重要新途徑，目前鮮少有報道在50 g/L 高濃度海藻酸鈉培養(yǎng)基中仍保持酶活力較強的菌株，近年來多數(shù)報道的降解菌直接利用褐藻膠的濃度低于50 g/L[11?13]。

本研究從北海潿洲島采集的馬尾藻中篩選得到一株褐藻膠降解菌Vibrio ganglieiM0101，該菌株對海藻酸鈉具備很強的水解能力，通過對菌株M0101 的產酶條件進行優(yōu)化，為后期該菌株在生產上的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 篩選自廣西北海潿洲島（109°08′00″E，21°01′00″N）的馬尾藻；海藻酸鈉培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 15 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，海藻酸鈉6 g/L，pH7.5；（NH4）2SO4分析純，廣東光華科技股份有限公司；K2HPO4分析純，天津市大茂化學試劑廠；NaCl分析純，成都金山化學試劑有限公司；MgSO4·7H2O

分析純，天津博迪化工股份有限公司；3, 5-二硝基水楊酸 化學純，成都市科龍化工試劑廠；FeSO4·7H2O 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；海藻酸鈉 分析純，阿拉??；H2SO4分析純，廉江市廉化試劑有限公司。

HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TS-200B 恒溫搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司；LHS-250SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海天呈實驗儀器制造有限公司；Tprofessional PCR 儀 德國biometra；1-14K 小型高速冷凍臺式離心機 德國Sigma；Sherolock 全自動細菌鑒定系統(tǒng) 美國MIDI（Microbial Identification）公司；HP6890 氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈉降解菌的分離 稱取0.2 g 馬尾藻，置于1.5 mL 的無菌離心管中，加入0.8 mL 無菌水，用電動研磨棒研磨成勻漿液，取勻漿液進行10 倍梯度稀釋，取0.1 mL 稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，將平板倒置于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，挑取生長好、形態(tài)和顏色不同的菌落進行純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物。

1.2.2 產酶菌株的篩選 挑取單菌落點接于海藻酸鈉培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，以10%（w/v）氯代十六烷基吡啶覆蓋平板染色（chlorhexadecyl pyridine，CPC）15 min，將顯示水解圈的菌株進行褐藻膠裂解酶相對酶活力測定。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 生理生化特征檢測 在平板上挑取單菌落至液體分離培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng) 24 h，將菌液用無菌生理鹽水稀釋到適當濃度，取 100 μL 涂布于初篩培養(yǎng)基中，30 ℃下倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌株形態(tài)，形態(tài)鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]，將菌體送至中國科學院微生物研究所，由其完成生理生化特征檢測和細胞脂肪酸組成測定。

1.2.3.2 細胞脂肪酸組成測定 使用Sherolock 全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行菌體脂肪酸成分分析，采用HP6890 氣相色譜儀進行色譜分析，配備分流/不分流進樣口，氫火焰離子檢測器（FID）及HP 氣相色譜化學工作站（HP CHEMSTATION ver A 5.05）；色譜柱為UItra-2 柱，長25 m，內徑0.2 mm，濾膜厚度0.33 μm；爐溫為二階程序升溫：起始溫度170 ℃，每分鐘5 ℃升至260 ℃，隨后以40 ℃/min 升至310 ℃，維持1.5 min；進樣口溫度250 ℃，載氣為氫氣，流速0.5 mL/min，分流進樣模式，分流比100:1，進樣量2 μL；檢測器溫度300 ℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，補充氣（氮氣）流速30 mL/min。

1.2.3.3 分子生物學鑒定 菌株DNA 的提取采用Chelex-100 法，用無菌牙簽挑取少量菌體于1.5 mL的離心管中，加入50 μL 10% 的Chelex-100 溶液，振蕩混勻，于100 ℃加熱10 min，冷卻至室溫后，12000 r/min 離心10 min，上清液即可用于后續(xù)的DNA 擴增。采用 16S rRNA 通用引物 27F（5' GAG TTTGATCCTGGCTCAG 3'）、1492R（5'GGTTACCTT GTTACGACTT 3'）進行 PCR 擴增，擴增產物送至上海生工進行測序，測序結果在NCBI（National Center for Biotechnology Information）核苷酸數(shù)據(jù)庫上進行BLAST 分析，選取同源性高的 16S rRNA 序列，采用MEGA7.0（鄰接法，Neighbor-Joining）構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株產酶活力測定 待測菌株用海藻酸鈉液體培養(yǎng)基活化24 h 作為種子培養(yǎng)液，按接種量3%（v/v）接種于裝液量為50 mL 的150 mL 三角瓶中，置于搖床上，30 ℃，200 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)48 h 后，取發(fā)酵液于4 ℃，12000 r/min 離心5 min，上清作為粗酶液進行產酶活力測定。采用 3，5-二硝基水楊酸法（DNS）進行海藻酸鈉裂解酶活力測定[15]，方法略有改動。取100 μL 發(fā)酵上清液和900 μL10 g/L 褐藻酸鈉溶液（pH7.5 的PBS 配制）混合，在30 ℃下水浴30 min 后，加入0.5 mL DNS 緩沖液沸水浴5 min 終止反應，對照組不水浴直接添加0.5 mL DNS 試劑后沸水浴 5 min，冷卻后定容至5 mL，測定OD540nm。

酶活力單位（U/mL）定義為: 在 30 ℃ 條件下，每分鐘催化底物產生 1 μg 還原糖（以葡萄糖計）需要的酶量為一個酶活力單位。

相對酶活力測定: 將試驗組的最高酶活力定義為 100%，將其他條件下的酶活力與最高酶活力的比值定義為相對酶活力。

1.2.5 產酶條件優(yōu)化 以海藻酸鈉培養(yǎng)基（如1.1 所列）進行產酶條件的優(yōu)化，在（NH4）2SO4濃度為5 g/L，NaCl 濃度為 15 g/L，初始pH 為7.5，培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉速為 200 r/min 的條件下考察海藻酸鈉濃度（18、20、22、24、26、28、32、40、50 g/L）對菌株產酶能力的影響；并依次考察氮源濃度（0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 g/L）；溫度（25、30、35、40、45 ℃）、轉速（100、150、200、250、300 r/min）、初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9、9.5、10.0）及NaCl 濃度（0、20、30、40、60、80、100、120、140、160 g/L）對菌株產酶能力的影響，以確定一個因素的最適條件為基準，依次對其余因素進行優(yōu)化，確定菌株的產酶優(yōu)化方案。

1.2.6 菌株生物量的測定 生物量通過OD600的大小來反映，以8 g/L 的海藻酸鈉液體培養(yǎng)基為空白對照，按一定倍數(shù)稀釋菌液，應用TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計進行OD600值測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用軟件Origin8.5 對數(shù)據(jù)進行處理、統(tǒng)計和繪圖。所有實驗均重復三次。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株的篩選與鑒定

在以褐藻膠為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行初篩，經10%（w/v）氯代十六烷基吡啶（Chlorhexadecyl pyridine，CPC）染色后，獲得6 株產酶菌株。將獲得的6 株產酶菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定其相對酶活力，發(fā)現(xiàn)菌株M0101 的相對酶活力最高（結果見圖1、圖2），后續(xù)將進一步對M0101 的產酶條件進行優(yōu)化。

圖1 不同產海藻酸鈉裂解酶菌株CPC（chlorhexadecyl pyridine）染色結果Fig.1 CPC straining of different alginate lyases-producing bacterial strains

圖2 不同產海藻酸鈉裂解酶菌株相對酶活力Fig.2 Relative enzyme activity of different alginate lyases-producing bacterial strains

菌株M0101 在篩選培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3 d，菌落呈圓形，邊緣整齊，淡黃色，表面光滑（圖3）。該菌株在葡萄糖、甘露醇、甘露糖、甘油、乙酰氨基葡糖、麥芽糖中均可生長，其基因組DNA 的G+C 含量為41.1mol%，與弧菌屬中相關菌種的生理生化特性的比較見表1。M0101 中主要脂肪酸成分及含量為C12:0（9.38%）, C14:0（4.24%）, C16:0（15.61%）, C18:1ω7c（14.69%）, C18:1ω9c（1.95%）, C14:03OH/C16:1iso 1（9.09%）, C16:1w7c/C16:1w6c（45.06%），與弧菌屬相關菌種的脂肪酸成分比較如表2 所示，經中國科學院微生物研究所檢測鑒定，菌株M0101 為弧菌Vibriosp.。

表1 菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strains

表2 不同菌株脂肪酸組成（%）Table 2 Fatty acids composition of different strains (%)

圖3 M0101 菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain M0101

對菌株的16S rDNA 進行PCR 擴增，產物經測序后，經同源性比對發(fā)現(xiàn)菌株M0101 與Vibrio ganglieiSZDIS-1 序列的相似性達100%，該菌株與其近源菌株16S rDNA 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，結合形態(tài)與生理生化特征分析，該菌株與弧菌Vibrio ganglieiSZDIS-1 相似性很高，將其命名為Vibrio ganglieiM0101。

圖4 菌株M0101 的16S rDNA 序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the 16S rRNA sequence of strain M0101

2.2 產酶條件優(yōu)化

2.2.1 碳源、氮源濃度優(yōu)化 培養(yǎng)基成分中海藻酸鈉（C 源）、硫酸銨（N 源）對菌株M0101 生長和相對酶活力影響的結果如圖5 所示。在18～50 g/L 海藻酸鈉濃度范圍內，隨著海藻酸鈉濃度的升高，菌株的海藻酸鈉裂解酶的相對酶活力和生物量呈上升的趨勢（圖5A）。盡管海藻酸鈉添加量為50 g/L 的培養(yǎng)基在接入M0101 種子液前呈現(xiàn)極為濃稠的膠狀，但接種發(fā)酵20 h 后，濃稠膠狀的培養(yǎng)基被水解成有較大流動性的溶液狀態(tài)，細菌在培養(yǎng)基中分布均勻，可直接稀釋一定倍數(shù)測定OD600反映其生物量。結果表明菌株M0101 具備水解高濃度海藻酸鈉的能力，其生物量和相對酶活力均在實驗的濃度范圍內達到最大值（圖5A）。在更高的海藻酸鈉濃度條件下，菌株M0101 可能具有更高的水解酶活力，這有待進一步作深入研究，本文沒有繼續(xù)探討其水解海藻酸鈉的能力極限與發(fā)酵時間的關系，故選擇海藻酸鈉添加量為50 g/L 為基準作后續(xù)優(yōu)化。

在0.5～8 g/L 的濃度范圍內，（NH4）2SO4對M0101生物量和相對酶活力的影響見圖5B。當（NH4）2SO4質量濃度在0.5～2 g/L 時，隨著氮源濃度增加，菌株生物量和相對酶活力均隨之增加，當（NH4）2SO4質量濃度為2 g/L 時，菌株的相對酶活力達到最大值，之后隨著氮源濃度的繼續(xù)增加，生物量處于穩(wěn)定的狀態(tài)，而相對酶活力有所波動，綜合考慮生物量、相對酶活力因素及用料成本，選擇（NH4）2SO4的添加量為2 g/L，以此為基準作后續(xù)優(yōu)化。

圖5 不同碳源、氮源濃度對菌株M0101 產酶和生長的影響Fig.5 The effect of different concentration of carbon source and nitrogen source on enzyme production and growth of strain M0101

2.2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化 不同溫度、轉速和初始pH 發(fā)酵條件對菌株M0101 產酶和生長影響結果如圖6所示。隨著發(fā)酵溫度升高，菌株的生長和相對酶活力增加，相對酶活30 ℃時達到最大值，35 ℃時相對酶活力持平，隨后隨著溫度增加而逐步下降。生物量在35 ℃后下降明顯，相對酶活力受溫度影響相對較低。當45 ℃時，菌株仍能生長，但生物量只有高峰值的三分之一，相對酶活力達到高峰值的80%左右（圖6A）；故本研究以較溫和的溫度30 ℃為基準作后續(xù)優(yōu)化。

轉速對菌株相對酶活力影響不大，但對菌株的生長具有一定的影響（圖6B），隨著轉速的增加，相對酶活力呈較平穩(wěn)狀態(tài)，而菌株的生長呈上升的趨勢，轉速低于200 r/min 時，菌株的生長受抑制，可能與轉速影響培養(yǎng)基中的容氧量相關。轉速在200～300 r/min 的范圍內，相對酶活力有所波動，但轉速分別為200 r/min 和300 r/min 時，相對酶活力沒有顯著性差異（P=0.065>0.05），故后續(xù)實驗選擇的轉速為200 r/min，以此為基準作進一步優(yōu)化。

初始pH 對菌株產酶和生長影響結果如圖6C所示，在pH5.5～9.5 范圍內，其相對酶活力和菌株生長隨pH 升高而呈上升趨勢，pH 為9.5 時，相對酶活力達到最大值，且與pH 為9.0 時比較，相對酶活力相差不大，沒有顯著性差異（P=0.605>0.05）；當pH大于9.5 時，菌株的相對酶活力和生長能力急劇下降。綜合考慮生物量、相對酶活力因素及未來可能的實際應用，后續(xù)實驗選擇的最適宜的酸堿度為pH9.0，以此為基準進一步優(yōu)化NaCl 濃度。

圖6 不同培養(yǎng)條件對菌株M0101 產酶和生長的影響Fig.6 The effect of different culture conditions on enzyme production and growth of strain M0101

2.2.3 NaCl 濃度優(yōu)化 菌株M0101 分離自腐爛的馬尾藻，其生長和產酶需要一定的鹽度，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl 對菌株M0101 的生長和產酶影響很大。由圖7 可知，M0101 的生長和產酶能力與NaCl 的濃度密切相關，當NaCl 濃度為100 g/L時，菌株的生物量和相對酶活力均達到最高值，尤其是生物量明顯高于其他條件，說明其能適應高濃度NaCl 環(huán)境，與其同源性很高的菌株Vibrio ganglieiSZDIS-1 能在NaCl 濃度高達14%（140 g/L）的環(huán)境中生長[19]，表明兩者同為耐鹽菌；M0101 具有耐鹽性推測與菌株生長的海洋環(huán)境相關；當NaCl 濃度繼續(xù)增加，菌株的生長和相對酶活力急劇下降，NaCl 濃度大于140 g/L 時，不利于菌株的生長和產酶。綜上所述，選擇NaCl 的濃度為100 g/L。

圖7 不同NaCl 濃度對菌株M0101 產酶和生長的影響Fig.7 The effect of different concentration of NaCl on enzyme production and growth of strain M0101

2.2.4 優(yōu)化前后菌株M0101 生長和產酶能力 根據(jù)上文優(yōu)化結果，產酶優(yōu)化方案確定為：海藻酸鈉50 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 100 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，初始pH9.0，30 ℃，200 r/min。菌株M0101 發(fā)酵條件優(yōu)化前后的生長及產酶能力如圖8 所示，優(yōu)化前，菌株M0101 發(fā)酵過程中延滯期較短，24 h 以前已達到穩(wěn)定期（見圖8A），酶活力也處于平穩(wěn)狀態(tài)（圖8B），酶活力較低。優(yōu)化后，菌株M0101 對海藻酸鈉有較強的利用能力，培養(yǎng)基中碳源濃度高，粘稠，菌株發(fā)酵過程中延滯期延后，24 h 以前處于延滯期，經24 h 發(fā)酵后，濃稠狀態(tài)的培養(yǎng)基（含50 g/L 海藻酸鈉的培養(yǎng)基呈濃稠狀態(tài)）才被水解為流動的溶液狀態(tài)，菌體在培養(yǎng)基中均勻分布，此時可利用紫外可見光分光光度計測定600 nm 處的吸光度值，以此反映發(fā)酵菌株的生物量。32 h 后菌株進入對數(shù)生長期（圖8A），是海藻酸鈉裂解酶迅速積累期，發(fā)酵32 h 酶活力達到最大值221.90 U/mL（圖8B），48 h 后菌株的生長到達穩(wěn)定期，此時酶活力已開始逐漸降低。相較于發(fā)酵條件優(yōu)化前最大酶活36.32 U/mL，優(yōu)化后酶活力是優(yōu)化前的6.11 倍。

圖8 菌株M010 發(fā)酵條件優(yōu)化前后生長及產酶曲線Fig.8 Growth and enzyme production curve of strain M0101 before and after optimization of fermentation conditions

3 討論與結論

褐藻膠裂解酶酶活的高低是微生物吸收利用褐藻膠的關鍵，其作為一種用途廣泛的工具酶，在制備低分子質量的褐藻膠寡糖時，因反應條件溫和、專一性強、得率高而逐漸成為制備褐藻膠寡糖的主要方式[20?21]。近年來，從細菌中分離出了許多褐藻膠裂解酶，產酶菌屬主要包括Vibrio[22?23]、Flavobacterium[24?25]、Pseudomonas[26?27]、Microbulbifer[28?29]等。本研究中產酶菌株是從北海潿洲島采集的馬尾藻中分離出來的一株產褐藻膠裂解酶菌株，根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA 基因序列分析，鑒定為弧菌屬Vibrio，命名為Vibrio ganglieiM0101?；【鷮賰炔煌甑暮衷迥z裂解酶活力存在較大差異，李云濤等[30]對Vibriosp.SS-1 通過響應面法優(yōu)化后，酶活力最大可達191.8 U/mL，傅曉妍等[31]篩選到的弧菌Vibriosp.QY102 優(yōu)化培養(yǎng)120 h 后，產酶達10.2 U/mL，與本文中Vibrio ganglieiM0101 發(fā)酵優(yōu)化后，產酶活性達221.90 U/mL 比較，均存在差異，推測與褐藻膠裂解酶相關基因的差異有關。培養(yǎng)基的成分在微生物發(fā)酵過程中對細菌的產酶活力具有決定性作用，合適的碳、氮、金屬離子能夠促進菌株的生長和產酶[32]。菌株M0101 能夠高效利用高濃度海藻酸鈉，隨著海藻酸鈉濃度的升高，菌株的褐藻膠裂解酶活力和生物量呈上升的趨勢，具備高效水解高濃度海藻酸鈉（50 g/L）的能力。NaCl通常起著維持菌體內外滲透壓、維持細胞內外電勢差、參與物質運輸?shù)淖饔?，在以褐藻膠為碳源的微生物培養(yǎng)基中，還起著運送褐藻膠大分子進入細胞膜的作用，當培養(yǎng)基中NaCl 質量濃度高達100 g/L 時，菌株 M0101 仍能正常生長，符合海洋細菌嗜鹽的特點，與其他同類型產海藻酸鈉裂解酶的嗜鹽菌株相比，該菌株的鹽耐受性較強[33]；同時，NaCl 還能影響海藻酸鈉裂解酶的活性，Xu 等[34]報道的PL7 家族海藻酸鈉裂解酶AlyC3 是一種新型的耐低溫、鹽活化酶，NaCl 濃度為0.5 mol/L（29.25 g/L）時酶活力最強，且濃度為3 mol/L（175.5 g/L）時酶活力仍高于沒有NaCl 存在時。Huang 等[35]發(fā)現(xiàn)V. weizhoudaoensisM0101（Vibrio ganglieiM0101）中的algM4 基因編碼的AlgM4 酶是一種新型的鹽活化的雙功能酶，經克隆、表達、純化該雙功能酶，發(fā)現(xiàn)其最適的NaCl濃度為1 mol/L（58.5 g/L），NaCl 不僅改變了該酶的二級結構元素的組成，同時也提高了該酶的熱穩(wěn)定性；該酶的最適NaCl 濃度與其菌體產酶的最適濃度（100 g/L）差異大，對M0101 基因組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)M0101 具有5 種海藻酸鈉裂解酶編碼基因，推測這種差異與M0101 能同時表達多種褐藻酸鈉裂解酶有關。

對培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，確定菌株M0101 最佳產酶條件為海藻酸鈉50 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 100 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，初始pH9.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉速200 r/min，在此條件下可獲得最大酶活為221.90 U/mL，是優(yōu)化前的6.11 倍。這為高活性褐藻膠裂解酶工業(yè)制備和褐藻膠寡糖生產提供了理論依據(jù)。