徐 偉，張 雪，王植朔，謝紅瑤，吳 凡，邵百琪

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150028）

內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）定殖于健康的生物組織內(nèi)部[1]，是構(gòu)成菌物生態(tài)系統(tǒng)的天然組分，目前，具有抑菌、抗癌等活性的大量次級代謝產(chǎn)物從內(nèi)生真菌中分離出來[2?5]，且研究表明，在內(nèi)生真菌與宿主保持著互惠共生關(guān)系的長久進(jìn)化過程中，其具有與宿主相同或相近的代謝途徑，從而產(chǎn)生與宿主相同或相近的次級代謝產(chǎn)物[6]，故內(nèi)生真菌可成為潛在的替代藥源，也將成為開發(fā)生物活性物質(zhì)的資源寶庫[7]，并且內(nèi)生真菌之間通過相互作用共同促進(jìn)宿主的生長發(fā)育，也可與大型真菌的協(xié)同作用促進(jìn)宿主產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物。

牛肝菌（Boletaceae）是真菌界（Fungi），擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricates）的大型真菌[8]，我國已知牛肝菌科有28 屬，397 種及變種[9]，主要產(chǎn)地在云南。其子實(shí)體含有大量人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、以及多種生物活性成分[10?11]，具有降血脂、抗氧化、護(hù)肝、抗腫瘤、降血糖、清熱解煩等功能[12?16]。牛肝菌是一個復(fù)雜的生命體，其整個生命周期都伴隨著內(nèi)生真菌，據(jù)報道，大部分牛肝菌是優(yōu)良的外生菌根真菌，其生長對寄主要求嚴(yán)格，絕大多數(shù)種類仍不能通過人工栽培形成子實(shí)體[17?18]。目前，對于牛肝菌的研究主要集中在化學(xué)成分、生物活性等方面[19?20]，而對于牛肝菌內(nèi)生真菌的報道較少。丁小維等[21]采用組織分離法從牛肝菌子實(shí)體中分離出2 株內(nèi)生真菌，通過ITS 分子鑒定分別為毛霉屬（Mucorsp.）和黃瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus），2 株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液均對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌活性。岳萬松等[22]采用組織分離法從4 種牛肝菌子實(shí)體中分離出5 株內(nèi)生真菌，經(jīng)ITS 分子鑒定分別為毛栓菌（Trametes hitsuta）、假絲酵母屬（Candidasp.）、被孢霉屬（Mortierellasp.）、散囊菌屬（Eurotiumsp.）、金色毛殼菌（Chaetomium aureum），經(jīng)過rDNA ITS 二級結(jié)構(gòu)輔助分析后，得出牛肝菌內(nèi)生真菌具有多樣性特征的結(jié)論。

在野生牛肝菌子實(shí)體獲得母種菌絲的分離過程中，明確與其內(nèi)生真菌的關(guān)系，是獲得原種、栽培種的基礎(chǔ)，也是獲得新的真菌資源途徑之一，故探究野生牛肝菌內(nèi)生真菌的生長規(guī)律及內(nèi)生真菌之間的拮抗關(guān)系，可為深入研究野生牛肝菌與內(nèi)生真菌之間的關(guān)系進(jìn)行初步探究。組織分離法是分離內(nèi)生真菌的重要方法之一，本研究通過組織分離法從3 種新鮮野生牛肝菌中分離獲得4 株內(nèi)生真菌，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和rDNA ITS 序列分析，對菌株進(jìn)行鑒定，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，并對幾種內(nèi)生真菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，可為牛肝菌生長過程及采摘后的生物防腐提供優(yōu)良的生防菌株，同時為開發(fā)新資源化合物提供菌種資源[23?25]，對牛肝菌的開發(fā)利用及人工栽培等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮野生牛肝菌子實(shí)體：黃皮疣柄牛肝菌（Leccinum crocipodium（Letellier）watl.）、小美牛肝菌（Boletus speciosusFrost）、雙色牛肝菌（Boletus bicolorPeck）

分別采摘于云南省楚雄彝族自治區(qū)祿豐縣和南華縣，無菌袋、冰袋封裝，空運(yùn)24 h 內(nèi)分離；GK2043（膠回收試劑盒）、GK1071（DNA 提取試劑盒）、引物ITS1 和ITS4 上海捷瑞生物工程有限公司合成；固體培養(yǎng)基CPDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB11 mg，蛋白胨0.5 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 自然（液態(tài)培養(yǎng)基去掉瓊脂）；固體培養(yǎng)基Pachlewski：葡萄糖20 g，酒石酸銨0.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，VB10.1 mg，瓊脂20 g，1 mL/L 微量元素混合液（H3BO38.45 mg，MnSO45 mg，F(xiàn)eSO46 mg，CuSO40.625 mg，ZnCl22.77 mg，（NH4）2MoO40.27 mg），去離子水1 L、固體培養(yǎng)基MMN：NaCl 0.025 g，葡萄糖10 g，KH2PO40.5 g，麥芽浸粉3.0 g，VB10.1 mg，CaCl20.05 g，（NH4）2HPO40.25 g，瓊脂20 g，F(xiàn)eCl30.012 g，MgSO4·7H2O 0.15 g；75%乙醇 實(shí)驗(yàn)室自制；

JY300C 電泳儀、JY02G 凝膠成像系統(tǒng) 北京君意電泳設(shè)備有限公司；Beckman-JT-25R 高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；ABI3730 測序儀 北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 野生牛肝菌內(nèi)生真菌分離與純化 將新鮮野生牛肝菌子實(shí)體用自來水沖洗數(shù)次，去除表面雜質(zhì)，無菌水沖洗4 遍，75%乙醇漂洗2 min，再用無菌水沖洗5 次，無菌紗布擦干子實(shí)體表面。采用組織分離法進(jìn)行以下操作，用無菌解剖刀將牛肝菌子實(shí)體縱切開后，將內(nèi)部的組織切割成0.5 cm2左右的小塊，接種于CPDA 培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)5 d。待小塊組織周圍有內(nèi)生真菌菌絲長出后，挑取少許菌絲，采用點(diǎn)植法純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接4 次。共獲得23 株純菌株，并移接至斜面試管4 ℃保存。

1.2.2 野生牛肝菌內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定 將23 株真菌分別點(diǎn)植固體平板培養(yǎng)，挑選出形態(tài)、顏色有明顯差異的菌落4 株，分別接種到CPDA 固體平板上，25 ℃避光培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)，顯微鏡觀察菌絲及分生孢子顏色、形態(tài)，以十字交叉法記錄菌落直徑，且移接至斜面試管，待培養(yǎng)長出菌絲體后，4 ℃保存。

1.2.3 基于rDNA ITS 序列分析的內(nèi)生真菌分子鑒定 采用GK1071 提取試劑盒，對4 株純化菌株進(jìn)行DNA 提取。使用真菌ITS 鑒定通用引物：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3’對DNA 的ITS 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為30 μL 反應(yīng)體系，包括：10×Taq Buffer 3 μL，dNTP 1 μL，Taq 酶1 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至30 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，5 min，95 ℃，15 s，95 ℃，15 s，95 ℃，45 s，35 個循環(huán)，72 ℃，5 min 保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳體系檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒GK2043 回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。將4 株內(nèi)生真菌所測序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST 對比，選擇同源性高于95%的序列，運(yùn)用MEGA-X 軟件進(jìn)行多重比較，通過NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以bootstrap 對發(fā)育樹進(jìn)行自舉法檢驗(yàn)1000 次，從而確定菌株的親緣關(guān)系及分類地位。

1.2.4 液態(tài)發(fā)酵及干基生物量的測定 接種1 cm2菌絲塊于裝液量為80 mL 的250 mL 三角瓶中，在25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min 培養(yǎng)，分別稱量2、4、6、8、10 d 的生物量干重，每組設(shè)置3 個重復(fù)，將發(fā)酵液在5000 r/min 離心10 min，收集菌絲體移至干燥皿中，置于70 ℃烘箱中，每隔1 h 取出稱量，直到重量不再改變，即為生物量干重。

1.2.5 野生牛肝菌內(nèi)生真菌的拮抗實(shí)驗(yàn) 為探究牛肝菌自身內(nèi)生真菌之間的拮抗作用，參照劉青等[26]方法利用平板對峙法進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，將純種菌種接種到新的CPDA 培養(yǎng)基上，接種后的平板置于25 ℃條件下避光培養(yǎng)，培養(yǎng)至5 d，期間觀察菌落形態(tài)，十字交叉法測量菌落生長直徑，以第5 d 時菌落直徑計算抑菌率。對照組設(shè)置為單獨(dú)接種腐敗菌（BBFO-10 尖孢鐮刀菌為腐敗菌），每組對峙設(shè)置3 組重復(fù)，抑菌率（%）=（對照組病原菌的菌落直徑-對峙組病原菌的菌落直徑）/對照組病原菌的菌落直徑×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)表示。利用Excel 2007 和 Origin 2018對生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

從云南省2 個地區(qū)采摘的3 個種的野生牛肝菌子實(shí)體，共分離出可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌23 株，通過菌落形態(tài)初步判斷多數(shù)為木霉屬，從中篩選出具有菌落形態(tài)、顏色、氣味等差異大的4 株菌種，接種于CPDA 培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng)5 d，平板生長的菌落形態(tài)、光學(xué)顯微鏡觀察的菌絲、孢子形態(tài)，利用Motic Images Plus 2.0 軟件進(jìn)行顯微形態(tài)（10×100）拍攝，如圖1 所示，特征描述見表1。

表1 野生牛肝菌4 種內(nèi)生真菌形態(tài)觀察結(jié)果的描述Table 1 Description of morphological observation results of 4 species of endophytic fungi in wild boletus

圖1 4 種主要內(nèi)生真菌的菌落、菌絲、孢子形態(tài)結(jié)果Fig.1 Morphological diagram of colony, hyphae and spores of wild bolete endophytic fungi

2.2 4 種內(nèi)生真菌菌株ITS 序列PCR 擴(kuò)增結(jié)果

進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以引物ITS1 和ITS4 對內(nèi)生真菌的DNA 模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得4 條長度均在410～610 bp 之間的特異性片段，4 株內(nèi)生真菌的ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，如圖2 所示。

圖2 4 株野生牛肝菌內(nèi)生真菌的ITS-PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of ITS-PCR amplification of 4 strains of endophytic fungi of wild bolete

2.3 4 種內(nèi)生真菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及分析

利用ITS 通用引物（ITS1、ITS4）對4 株內(nèi)生真菌進(jìn)行序列擴(kuò)增得到4 條基因序列，序列長度分別是LCTG-12 為580 bp；LCCK-6 為410 bp；BSHC-18 為610 bp；BBFO-10 為600 bp。將以上4 條序列分別在NCBI 庫中進(jìn)行在線BLAST 比對，每種菌下載4～5 條同源性高于95%的序列，以測序得到的基因序列為基礎(chǔ)，同公共數(shù)據(jù)庫下載的相似序列合并，采用MEGA-X 軟件，按照neighbor-joining method（N-J 法），經(jīng)過自舉法1000 次進(jìn)行檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以此對菌株進(jìn)行種水平的分類鑒別。4 株菌在NCBI 中BLAST 比對結(jié)果顯示：在100 條序列比對結(jié)果中，LCTG-12 與76 株木霉屬序列（Trichodermasp.）的序列同源性為99%以上，說明該菌為木霉屬；LCCK-6 與55 株念珠菌屬（Candida）的序列同源性為90%以上說明該菌為念珠菌屬；BSHC-18與50 株菌寄生屬（Hypomycessp.）的序列同源性為90%以上說明該菌為菌寄生屬；BBFO-10 與94 株（Fusarium oxysprum）的序列同源性為99%以上。

系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝的長短表示各菌株之間的遺傳距離，同一支說明親緣關(guān)系很近，以系統(tǒng)發(fā)育方法可以對關(guān)系較為密切的菌株序列進(jìn)行較好的判別。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及BLAST 對比及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果：LCTG-12 與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Trichoderma gamsii聚類在同一支上，自檢支持率100%，鑒定該菌為蓋姆斯木霉；LCCK-6 與Candida kruisii聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為克魯伊假絲酵母；BSHC-18 與Hypomyces chrysospermus聚類在同一支上，自檢支持率為100%，鑒定該菌為黃瘤孢菌；BBFO-10 與Fusarium oxysprum聚類于同一株上，自檢支持率達(dá)100%，鑒定該菌為尖孢鐮刀菌（圖3）。

圖3 NJ 法構(gòu)建4 株內(nèi)生真菌的ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖（Bookstrap≥50%）Fig.3 Construction of ITS sequence phylogenetic tree diagrams of 4 endophytic fungi by NJ method（Bookstrap≥50%）

2.4 野生牛肝菌內(nèi)生真菌的生物學(xué)特性

2.4.1 3 種培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌生長速度的影響 為掌握4 株內(nèi)生真菌（LCTG-12、LCCK-6、BSHC-18、BBFO-10）的生物學(xué)特性，選擇CPDA、Pachlewski、MMN 為供試培養(yǎng)基，研究3 種培養(yǎng)基對菌絲生長速度的影響，25 ℃培養(yǎng)，在9 cm 的平板上采用十字交叉法測量菌落直徑，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，在培養(yǎng)第4 d 時進(jìn)行菌落直徑測量，CPDA 上的生長速度明顯優(yōu)于其他2 種培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌LCTG-12 培養(yǎng)5 d，LCCK-6 培養(yǎng)6 d，BSHC-18 培養(yǎng)7 d，BBFO-10 培養(yǎng)8 d 可長滿平板，故選擇CPDA 培養(yǎng)基為4 種內(nèi)生真菌的最適培養(yǎng)基。

圖4 培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌生長的影響Fig.4 The influence of culture medium on the growth of endophytic fungi

2.4.2 液態(tài)發(fā)酵對內(nèi)生真菌生物量的影響 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇CPDA 培養(yǎng)基進(jìn)行4 種內(nèi)生真菌的液態(tài)搖瓶實(shí)驗(yàn)，在25 ℃，160 r/min 條件下培養(yǎng)0～10 d，收集0、2、4、6、8、10 d 的菌絲，3 次平行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知，0～8 d LCTG-12、LCCK-6、BBFO-10 生物量均呈增長趨勢，第8 d時LCTG-12 的生物量為4.13 g/L，LCCK-6 為1.65 g/L，BBFO-10 為3.44 g/L，此時生物量最大，之后不再增長，這可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡有關(guān)。但是BSHC-18 的液態(tài)發(fā)酵菌絲量增長緩慢，最高為1.14 g/L，這與黃瘤孢菌（BSHC-18）的孢子繁殖的生物學(xué)特性有關(guān)，可見它不適于液態(tài)發(fā)酵生長菌絲。

圖5 4 株野生牛肝菌內(nèi)生真菌的生物量Fig.5 Biomass of 4 wild bolete endophytic fungi

2.4.3 野生牛肝菌內(nèi)生真菌的拮抗性 為探究牛肝菌內(nèi)生真菌之間是否存在拮抗關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計從牛肝菌中分出的3 株內(nèi)生真菌，進(jìn)行對峙實(shí)驗(yàn)，在25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，蓋姆斯木霉LCTG-12、黃瘤孢菌BSHC-18 和尖孢鐮刀菌BBFO-10 的對照組菌落形態(tài)如圖1-a-1、1-c-1 和1-d-1 所示，拮抗對峙圖如圖6所示。

圖6 牛肝菌內(nèi)生真菌之間的拮抗對峙圖Fig.6 Picture of antagonism between wild bolete endophytic fungi

由圖6a 可知，蓋姆斯木霉對尖孢鐮刀菌的生長具有拮抗作用，其菌落與鐮刀菌接觸的邊界處，鐮刀菌有明顯向外退縮生長，由于每組對峙設(shè)置3 組重復(fù)，故其對尖孢鐮刀菌的平均抑制率為53.7%；由圖6b 可知，黃瘤孢菌與尖孢鐮刀菌之間可互相抑制生長，且黃瘤孢菌產(chǎn)黃色孢子的時間明顯延后，彼此的平均抑制率分別為：41.8%、33.6%；由圖6c 可知，蓋姆斯木霉對黃瘤孢菌的生長有明顯的抑制作用，黃瘤孢菌未有產(chǎn)孢現(xiàn)象，其對黃瘤孢菌的平均抑制率為74.7%。

3 結(jié)論

食藥用菌內(nèi)生真菌是一類尚未充分開發(fā)與利用，并且應(yīng)用前景廣泛的微生物，為探究野生牛肝菌中內(nèi)生真菌資源，及分析其內(nèi)生真菌間是否存在拮抗關(guān)系，本文從3 種新鮮野生牛肝菌子實(shí)體中分離純化共得到23 株純菌，篩選出4 株具有典型特征的純菌進(jìn)行形態(tài)觀察和ITS rDNA 現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定，鑒定出4 株內(nèi)生真菌分別為蓋姆斯木霉（Trichoderma gamsii）、克魯伊假絲酵母（Candida kruisii）、黃瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus） 及尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysprum），并對幾株內(nèi)生真菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，得出結(jié)論：CPDA 培養(yǎng)基較適合這4 株菌的生長，其中蓋姆斯木霉的生長速度較快，5 d 即可長滿9 cm 的平板，其余3 種菌株長滿板的時間分別為6、7、8 d，并且蓋姆斯木霉對黃瘤孢菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長均有拮抗作用，黃瘤孢菌和尖孢鐮刀菌兩者之間也具有拮抗作用。由于實(shí)驗(yàn)采用人工合成培養(yǎng)基的局限性，故本研究所分離的菌株不能完全詮釋野生牛肝菌內(nèi)生真菌的群系，其中蓋姆斯木霉菌株表現(xiàn)出的拮抗作用，表明其具有一定的生防應(yīng)用潛力，可為牛肝菌等大型真菌生長過程中會出現(xiàn)的菇體腐爛和根腐病[27?29]，提供一定的生防利用價值。內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物豐富[30?31]，進(jìn)一步研究其內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性廣泛的次級代謝產(chǎn)物，對新型藥用資源開發(fā)具有重要的意義，而牛肝菌內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物與其是否相同或相近還有待研究。本文也為之后野生牛肝菌人工馴化過程中，研究其內(nèi)部環(huán)境與內(nèi)生真菌的關(guān)系提供參考。