孫華偉

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)診斷檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

國(guó)內(nèi)豬病實(shí)驗(yàn)室從2010年的“懵懂”，2015年的“發(fā)展”到2018年的“普及”，給我國(guó)豬病診斷及防控工作帶來了巨大幫助。尤其是在2018年8月非洲豬瘟（ASF）暴發(fā)后，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在ASF精準(zhǔn)剔除（拔牙）、后ASF時(shí)代豬瘟、豬藍(lán)耳病等重大疫病的監(jiān)測(cè)評(píng)估、診斷防控及凈化中必將發(fā)揮重大作用。

1 熒光PCR檢測(cè)的原理

熒光PCR（Q-PCR）是利用熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化[1]。在Q-PCR反應(yīng)過程中，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物量增加，相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度也跟著增加，此時(shí)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)。經(jīng)過若干個(gè)循環(huán)后，可以得到一條以循環(huán)數(shù)（CT）為橫坐標(biāo)和熒光強(qiáng)度變化為縱坐標(biāo)的“S”形熒光擴(kuò)增曲線。理論上講經(jīng)過n個(gè)循環(huán)之后，模板量就會(huì)達(dá)到2的n次方。見圖1。

2 常見問題分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)“翹尾”，怎么處理？

首先按照要求進(jìn)行復(fù)查，復(fù)查建議重新采樣。如果不方便重新采樣建議對(duì)原有樣本重新進(jìn)行提取核酸驗(yàn)證，如果復(fù)查為陰性則判讀陰性；如果復(fù)查還是出現(xiàn)“翹尾”，就要對(duì)結(jié)果仔細(xì)審核。一是要排除實(shí)驗(yàn)室污染，二是要對(duì)病豬信息了解清楚，從臨床癥狀排查，如果仍沒法確認(rèn)，建議必須重新采樣復(fù)查，如有必要可以采用另一種試劑來驗(yàn)證。如果出現(xiàn)大量的弱陽性擴(kuò)增翹尾，首要原因是考慮實(shí)驗(yàn)室被污染，可以通過做環(huán)境樣本和陰性對(duì)照做驗(yàn)證排除。見圖2。

圖2 檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大量的弱陽性擴(kuò)增翹尾

2.2 非洲豬瘟檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符合，怎么解讀？

首先要明白“檢驗(yàn)結(jié)果與臨床不符”并非一個(gè)客觀的評(píng)價(jià)，而是一種主觀感覺，來源于個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)判斷。因此并不一定就是結(jié)果有誤，可能有其他方面的原因。之所以會(huì)這樣，主要是由于對(duì)“不符”的來源認(rèn)識(shí)不夠全面，不知道除了熟悉的實(shí)驗(yàn)室環(huán)節(jié)以外，還有哪些方面要去分析？只有對(duì)造成不符的原因有一個(gè)比較系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，才能做到有的放矢。下面簡(jiǎn)要介紹可能出現(xiàn)的原因：

2.2.1時(shí)間因素

非洲豬瘟病毒的感染有一個(gè)發(fā)生發(fā)展的過程，如果檢測(cè)時(shí)正好處于“窗口期”，就有可能出現(xiàn)漏檢的情況。“窗口期”并不是固定的，會(huì)隨著檢測(cè)方法敏感性的提高而縮短，但始終會(huì)存在。

2.2.2空間因素

取樣部位是否合格決定了結(jié)果的可靠性。不當(dāng)?shù)娜涌梢詫?dǎo)致結(jié)果假陰性的情況發(fā)生。如對(duì)活豬盡量采集喉部棉拭子及抗凝血，病死豬采集脾臟和淋巴結(jié)。

2.2.3送檢因素

檢驗(yàn)誤差絕大多數(shù)來源于分析前階段，標(biāo)本質(zhì)量決定結(jié)果是否可靠，樣本的現(xiàn)場(chǎng)選擇、采集、運(yùn)輸、處理等環(huán)節(jié)將直接影響檢測(cè)結(jié)果。

2.3 采集環(huán)境樣本，為什么大部分樣本內(nèi)標(biāo)不出，偶爾個(gè)別樣本檢測(cè)出內(nèi)標(biāo)？

因?yàn)榉侵挢i瘟試劑檢測(cè)的是豬內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，環(huán)境樣本有時(shí)不含有豬源細(xì)胞，所以檢測(cè)不出內(nèi)標(biāo)；偶爾檢出內(nèi)標(biāo)，可能該環(huán)境樣本上有豬源性細(xì)胞黏附，故而檢出內(nèi)標(biāo)。

3 小結(jié)

制定科學(xué)合理的日常監(jiān)測(cè)及異常檢測(cè)方案，避免過度、盲目檢測(cè)；檢測(cè)人員要專人專事，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化、流程化、固態(tài)化的“simple and good”檢測(cè)。

3.1 謹(jǐn)防移液器污染

核酸提取、試劑加樣等不同操作做到移液器專用，檢測(cè)過程，所有試劑要放置正前方，不可從敞口的試劑上方經(jīng)過；提倡空白/陰性對(duì)照要從核酸提取開始。對(duì)于污染：移液器的污染最為常見，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內(nèi)或粘上吸頭是重要的污染源，因而加樣吸取時(shí)要十分小心，慢吸，不要多次抽吸，避免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

3.2 噴灑專用核酸祛除劑

實(shí)驗(yàn)完畢，工作臺(tái)面、超凈臺(tái)、生物安全柜、移液器、離心機(jī)、熒光PCR儀等要使用專用的核酸祛除劑（84消毒液對(duì)儀器會(huì)有腐蝕作用）進(jìn)行消毒處理；實(shí)驗(yàn)室一旦污染，務(wù)必暫停使用，待有效處理，認(rèn)真評(píng)估后再復(fù)用。