江冉冉，陳麗霞，周蓓瀛

華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200

癲癇(epilepsy，EP)是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以感覺(jué)、意識(shí)、精神、行為等功能性障礙為主要臨床表現(xiàn)，具有反復(fù)、急性自發(fā)的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康。EP發(fā)作是大腦神經(jīng)元過(guò)度興奮和同步異常放電所致，該過(guò)程導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或丟失使EP病情進(jìn)行性加重[1-2]。EP發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是重要作用機(jī)制[3]。藏紅花素(又名西紅花苷)為中藥藏紅花的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡等作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡對(duì)缺血性腦損傷起到保護(hù)作用[6]，但是否對(duì)EP所致腦組織損傷具有保護(hù)作用，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠120只，雄性，7周齡，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。飼養(yǎng)條件：光照黑暗各12 h交替、室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度55%～65%。本研究經(jīng)華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：HBYLLL[K]字2020-017。

1.2 藥物與試劑藏紅花素(純度≥98%，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：17304-1G)；注射用丙戊酸鈉(四川科瑞德制藥股份有限公司，批號(hào)：20190826)。TUNEL染色試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：200319、200105、200422、200307)；核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 correlation factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體和β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-1074R、bs-2075R、bs-23217R、bs-0081R、bs-0061R)；氯化鋰(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：C8380)；匹羅卡品(上海阿拉丁試劑有限公司，貨號(hào)：P129614)；水合氯醛(北京化學(xué)試劑廠，批號(hào)：191128)；40 ng·L-1多聚甲醛(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180914)。

1.3 儀器RM2125型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；CKX31型倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；UV762型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海楚定分析儀器有限公司)；SE300型電泳儀、TE22型轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Hoefer公司)；EC3 410型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)UVPN公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥將120只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、藏紅花素(低、中、高劑量)組(5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1)[7]及丙戊酸鈉組(300 mg·kg-1)[8]，每組20只。除空白對(duì)照組外，其余各組均采用氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)點(diǎn)燃法制備EP大鼠模型[9]：腹腔注射氯化鋰溶液(127 mg·kg-1)，20 h后背部皮下注射匹羅卡品溶液(15 mg·kg-1)，丙戊酸鈉組和藏紅花素各劑量組均在注射匹羅卡品前30 min腹腔注射給予相應(yīng)劑量藥物1次(模型組給予生理鹽水)；空白對(duì)照組各步驟均同步給予生理鹽水。

2.2 EP模型大鼠首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時(shí)間及發(fā)作程度分級(jí)匹羅卡品注射后2 h內(nèi)觀察并記錄各組大鼠EP首次發(fā)作潛伏期和持續(xù)時(shí)間，對(duì)照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)EP發(fā)作程度進(jìn)行分級(jí)[10]：無(wú)發(fā)作為0級(jí)；口周及面部肌肉抽搐為1級(jí)；點(diǎn)頭或頻繁抖動(dòng)為2級(jí)；前肢局限性陣攣為3級(jí)；前肢局限性陣攣伴后肢站立的全身強(qiáng)直性發(fā)作為4級(jí)；前肢局限性陣攣伴有站立并摔倒、翻滾的全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作為5級(jí)。

2.3 HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)變化給藥結(jié)束后隨機(jī)取各組大鼠10只，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)麻醉，頸椎脫臼處死，斷頭取腦，去除小腦、腦干后置于40 ng·L-1多聚甲醛溶液固定72 h，石蠟包埋、5 μm厚度切片、梯度乙醇脫蠟和二甲苯透明，行HE染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變。

2.4 TUNEL法觀察海馬神經(jīng)元凋亡水平取“2.3”項(xiàng)下制備的各組大鼠的腦組織石蠟切片，經(jīng)梯度乙醇脫蠟和二甲苯透明后，按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行染色處理，封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元凋亡狀態(tài)；凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)計(jì)算：每只大鼠選取同部位5張染色切片，每張切片選取5個(gè)不重疊視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，取平均值。

AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%

2.5 檢測(cè)大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性分別取各組剩余的10只大鼠，麻醉后脊椎脫臼處死，在冰上斷頭取腦并剝?nèi)『ｑR組織，加入適量裂解液后研磨勻漿，4 ℃、3 000 r·min-1離心(離心半徑10 cm)10 min，取上清液，然后按試劑盒操作方法進(jìn)行處理，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性。

2.6 Western blot法檢測(cè)大鼠海馬組織蛋白表達(dá)取“2.5”項(xiàng)下制備的各組10只大鼠的海馬組織勻漿液，4 ℃、12 000 r·min-1離心(離心半徑 10 cm)25 min 取沉淀，通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白總濃度后，95 ℃水浴使蛋白變性，30 μg蛋白量上樣、SDS-PAGE膠電泳、濕法轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉37 ℃封閉 1 h 后，滴加目標(biāo)蛋白和β-actin一抗后，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育 1 h，洗膜后滴加DAB顯色，以β-actin為內(nèi)參半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時(shí)間及發(fā)作程度的影響與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠首次EP發(fā)作潛伏期極顯著延長(zhǎng)、發(fā)作持續(xù)時(shí)間極顯著縮短、發(fā)作程度分級(jí)極顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 藏紅花素對(duì)EP大鼠首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時(shí)間及發(fā)作程度的影響

3.2 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變的影響空白對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，排列整齊，核膜、核仁邊界清晰；模型組大鼠海馬神經(jīng)元可見(jiàn)形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂、層次不清、核膜不清，核仁固縮、偏移、深染等形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；藏紅花素低、中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)則、排列較整齊、核膜核仁邊界清晰，其中高劑量組改善最明顯。見(jiàn)圖1。

注：A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；D：藏紅花素中劑量組；E：藏紅花素高劑量組；F：丙戊酸鈉組圖1 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變的影響(HE染色，×400)

3.3 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯增多，AI極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少，AI極顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響

注：A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；D：藏紅花素中劑量組；E：藏紅花素高劑量組；F：丙戊酸鈉組圖2 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響(×400)

3.4 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性的影響與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織MDA活性極顯著升高(P<0.01)，SOD、CAT活性極顯著降低(P<0.01)；與較模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬組織MDA活性極顯著降低(P<0.01)，SOD、CAT活性極顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性的影響

3.5 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，NF-κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3，表4。

注：A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；D：藏紅花素中劑量組；E：藏紅花素高劑量組；F：丙戊酸鈉組圖3 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表4 藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

4 討論

EP是全球范圍內(nèi)重點(diǎn)防治的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，我國(guó)EP患者約900萬(wàn)，每年新發(fā)病例約45萬(wàn)，發(fā)病率(25～35)/10萬(wàn)。研究顯示，EP患者突發(fā)死亡風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的3倍[11-12]。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元過(guò)度興奮和同步異常放電導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成與蓄積，引發(fā)氧化應(yīng)激和繼發(fā)性細(xì)胞凋亡，是EP發(fā)作和神經(jīng)元退行性病變的核心環(huán)節(jié)[3]。因此，研究靶向抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的新型藥物可能是抑制EP發(fā)作并改善其預(yù)后的有效途徑。

藏紅花(又名番紅花)是一種鳶尾科番紅花屬多年生花卉，味甘、性平，具有活血化瘀、散郁開(kāi)結(jié)的功效。藏紅花素是藏紅花的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡活性，較易通過(guò)血腦屏障。研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡減輕大鼠缺血性腦損傷[6]。丙戊酸鈉是一種廣泛應(yīng)用于臨床的廣譜抗EP藥，也是EP相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的常用陽(yáng)性對(duì)照藥物。EP動(dòng)物模型的制備方法主要有電點(diǎn)燃和化學(xué)點(diǎn)燃兩大類，其中氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)點(diǎn)燃法制備的EP大鼠模型病理特征與人類高度相似，且操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性高，是目前公認(rèn)的EP大鼠模型制備方法[13]。本實(shí)驗(yàn)采用氯化鋰-匹羅卡品法制備EP大鼠模型，并以丙戊酸鈉為陽(yáng)性對(duì)照藥物，經(jīng)藏紅花素預(yù)處理能夠顯著延長(zhǎng)EP發(fā)作潛伏期、縮短發(fā)作持續(xù)時(shí)間、降低EP發(fā)作程度，明顯改善大鼠海馬神經(jīng)元病變并抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，且藏紅花素高劑量組效果優(yōu)于丙戊酸鈉組，提示藏紅花素對(duì)EP模型大鼠具有海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。

ROS過(guò)剩是發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，EP發(fā)作時(shí)大腦神經(jīng)元過(guò)度興奮和異常放電導(dǎo)致ROS大量生成，抗氧化酶(SOD、CAT)被過(guò)度消耗，導(dǎo)致ROS代謝失衡而蓄積[14-16]；過(guò)剩的ROS破壞核酸、蛋白質(zhì)及生物膜脂質(zhì)等分子結(jié)構(gòu)，生成具有生物毒性的MDA。因此，MDA、SOD、CAT活性能夠反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度[17]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制氧化應(yīng)激損傷能夠有效降低EP模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷[18-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藏紅花素預(yù)處理EP模型大鼠可顯著降低海馬組織MDA活性，升高SOD、CAT活性，且藏紅花素高劑量組效果最佳，提示藏紅花素對(duì)EP模型大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

Nrf2是真核細(xì)胞中普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下Nrf2與其特異性酶抑制劑Keap1結(jié)合而無(wú)活性，ROS能夠刺激Nrf2與Keap1解離而活化，游離的Nrf2核轉(zhuǎn)位后與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，促進(jìn)抗氧化酶(包括SOD、CAT)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[20-22]。HO-1通過(guò)催化降解血紅素、清除CO等抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，而HO-1是Nrf2的下游基因，Nrf2核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)[23-25]。Cleved Caspase-3參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)與執(zhí)行全過(guò)程，是細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的調(diào)控因子[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB能夠誘導(dǎo)Caspase-3的活化[29]；HO-1能夠通過(guò)抑制 NF-κB 啟動(dòng)子IKKβ磷酸化而抑制NF-κB活性[30]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)藏紅花素預(yù)處理EP模型大鼠可顯著升高海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，降低NF-κB、Cleaved Caspase-3表達(dá)，且藏紅花素高劑量組效果優(yōu)于丙戊酸鈉組，提示藏紅花素對(duì)EP模型大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，藏紅花素對(duì)EP模型大鼠具有抗癲癇和海馬神經(jīng)元保護(hù)作用，可能與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。