張夢(mèng)麒，李小輝，趙道強(qiáng)，鐘承志，吳德松

云南省藥物研究所/云南白藥創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖[1]，主產(chǎn)地為我國(guó)四川、湖南、河南、貴州等省，東北、華北等地區(qū)亦有分布[2]。半夏味辛性溫，有毒[3]，麻舌而刺喉[1]，對(duì)口腔和消化道黏膜有強(qiáng)烈的刺激性，可導(dǎo)致嘔吐、水瀉、喉頭水腫等不良反應(yīng)，而嚴(yán)重的喉頭水腫可致呼吸困難、窒息等癥狀，甚至引起死亡[4]。姜半夏為半夏藥材按照《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定經(jīng)煎煮炮制后得到的炮制品[1]。與半夏比較，姜半夏毒性降低[5]，因此，臨床上多采用半夏炮制品，如姜半夏、法半夏等代替半夏入藥。

目前，半夏的毒性研究主要涉及急性毒性[6-7]、刺激性[8-9]及胚胎毒性[10]，但未見(jiàn)姜半夏的毒性研究、半夏及姜半夏的安全性對(duì)比研究。因此，本文旨在對(duì)半夏及姜半夏安全性對(duì)比進(jìn)行初步研究，為半夏及姜半夏臨床使用的安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞SPF級(jí)ICR小鼠，雌性90只，雄性60只，體質(zhì)量18～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。30只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKX(京)2016-0011。SPF級(jí)日本大耳白兔24只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由昆明楚商科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)2018-0001。SPF級(jí)金黃地鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量120～140 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食。飼養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，相對(duì)濕度40%～70%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在云南白藥創(chuàng)新研發(fā)中心藥理實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物使用許可證：SYXK(滇)2017-0004。

小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，購(gòu)自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號(hào)：20190329AOF2。

1.2 藥物與試劑半夏(購(gòu)于云南省昆明市新螺螄灣國(guó)際商貿(mào)城中藥材市場(chǎng)，由云南白藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新研發(fā)中心天然藥物化學(xué)研究室鑒別清洗后使用，批號(hào)：20190227)。食用淀粉(成都達(dá)恒毛實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20180728)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1803302722)；伊文思藍(lán)(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10154249)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)、非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)、鼠重組白血病抑制因子(recombinant mouse leukemia inhibitory factor，LIF)(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1891605、2044404、1697785、8118211、STBH3182、2027433、0913-200-33-E)；MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：MKBS4732V、BCBV2983)；青-鏈霉素(以色列Biological Industries公司，批號(hào)：1638751)。

1.3 儀器JJ-2000型電子天平[美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司]；PL-203型電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；ELGA LA 613型超純水機(jī)[英國(guó)ELGA LabWater/VWS(UK)有限公司)；Multiskan Go型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司]；DMIL-LED型熒光倒置相差顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；AC2-6S1型二級(jí)生物安全柜、CCL-170A-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；DW-86L486型超低溫冰箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；3H12RI型高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司，離心半徑：7.5 cm)。

2 方法

2.1 藥物制備及半夏與姜半夏的顯微鑒別半夏粉制備：稱取250.5 g半夏藥材，粉碎，過(guò)100目篩，得到半夏粉227.4 g。姜半夏粉制備：取半夏藥材，洗凈，大小分開(kāi)，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心時(shí)，取出；另取生姜切片煎湯，加白礬與半夏共煮，取出，晾至半干，干燥；或切薄片，干燥。每100 kg半夏，加入生姜 25 kg、白礬12.5 kg炮制。稱取200 g姜半夏，粉碎，過(guò)100目篩，得姜半夏粉末130 g。對(duì)制備得到的半夏粉及姜半夏粉進(jìn)行顯微觀察，比較二者的不同。

2.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的2014 版《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》及文獻(xiàn)方法[11-12]，60只雌雄各半SPF級(jí)ICR小鼠按體質(zhì)量分為3組，即溶媒對(duì)照組、半夏粉組及姜半夏粉組，每組20只。給藥組以40 mL·kg-1的劑量給予 0.4 g·mL-1半夏或姜半夏溶液，24 h內(nèi)灌胃藥物3次，溶媒對(duì)照組灌胃等體積純水。每次給藥間隔5 h，給藥后立即喂水，末次給藥2 h后投喂飼料。給藥后觀察動(dòng)物的臨床癥狀(如動(dòng)物表觀、行為、飲食、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等)及死亡情況(死亡時(shí)間、瀕死前反應(yīng)等)，每天觀察1次，連續(xù)14 d。于給藥后第3天、第7天、第14天稱量小鼠體質(zhì)量。觀察期結(jié)束后處死小鼠，解剖后觀察小鼠臟器的體積、顏色、質(zhì)地等有無(wú)明顯異常。

2.3 日本大耳白兔眼部刺激實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[13-16]方法，選取SPF級(jí)雌雄各半的日本大耳白兔24只，按體質(zhì)量分為4組，即溶媒對(duì)照組、淀粉(陰性對(duì)照)組、半夏粉組及姜半夏粉組，每組6只，溶媒對(duì)照組給予生理鹽水，其余各組采用生理鹽水將淀粉、半夏粉及姜半夏粉配制成濃度為0.1 g·mL-1的藥液。將日本大耳白兔固定，用手將兔左側(cè)眼睛的上下眼瞼輕輕撩起，在眼部結(jié)膜囊處滴入0.2 mL相應(yīng)藥物混懸液，使兔眼部上下眼瞼被動(dòng)閉合10 s，使藥物與眼部充分接觸，右側(cè)眼部滴入等量的生理鹽水作為自身對(duì)照。刺激5 min后立即使用大量生理鹽水沖洗至眼中無(wú)任何異物。隨后觀察3 h內(nèi)大耳白兔眼部情況，根據(jù)刺激性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1及表2)進(jìn)行打分，評(píng)定眼刺激強(qiáng)度，并對(duì)大耳白兔眼部刺激的反應(yīng)情況進(jìn)行拍照記錄。

表1 大耳白兔眼部刺激性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 大耳白兔眼部刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.4 金黃地鼠口腔黏膜刺激性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[17-19]方法，將SPF級(jí)雌雄各半的金黃地鼠按體質(zhì)量分為溶媒對(duì)照組、半夏粉組及姜半夏粉組。實(shí)驗(yàn)前，對(duì)金黃地鼠右側(cè)口腔頰黏膜進(jìn)行檢查，確定無(wú)異常后，將藥物混懸液(藥物配置同2.3)滴在直徑約為5 mm的滅菌脫脂棉球上，并將棉球放入動(dòng)物右側(cè)頰囊處，動(dòng)物頸部帶上皮筋以避免動(dòng)物將棉球吐出，溶媒對(duì)照組給予生理鹽水刺激，每日刺激1次，每次15 min，連續(xù)7 d。每日給藥前、給藥1 h后、給藥4 h后觀察并記錄與藥物接觸的黏膜有無(wú)紅斑、糜爛和水腫等情況，按表3進(jìn)行評(píng)分。末次觀察結(jié)束后，處死動(dòng)物，觀察與藥物接觸部位及周?chē)a黏膜、氣管有無(wú)刺激反應(yīng)。

表3 金黃地鼠口腔黏膜刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.5 小鼠生殖毒性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[20-23]方法，將SPF級(jí)ICR雄性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組10只；SPF級(jí)ICR雌性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為溶媒對(duì)照組、半夏粉組及姜半夏粉組。將雌雄鼠按21比例合籠交配，于發(fā)現(xiàn)陰栓日定為妊娠0 d。所有雌鼠均于妊娠1 d開(kāi)始給藥，給藥組以20 mL·kg-1的劑量灌胃給予1.85 mg·kg-1相應(yīng)藥液，溶媒對(duì)照組灌胃等體積純水，每天1次，連續(xù)19 d。妊娠期第20天(即停藥24 h后)，將雌鼠放血處死，解剖，觀察仔鼠形態(tài)，并稱質(zhì)量。詳細(xì)記錄仔鼠總數(shù)、活胎數(shù)、發(fā)育正常數(shù)、死胎數(shù)、畸形數(shù)(包括頭部、四肢及軀干畸形)。

2.6 含藥血清對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞體外增殖影響的實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[24-28]，將SPF級(jí)雄性Wistar大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組、半夏粉組及姜半夏粉組，每組10只。給藥組按10 mL·kg-1的劑量灌胃1.05 mg·kg-1的相應(yīng)藥物，溶媒對(duì)照組灌胃等容積純水，每天1次，連續(xù)5 d，末次灌胃1 h后腹主動(dòng)脈取血，靜置后3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，并進(jìn)行滅活濾菌，制備半夏粉、姜半夏粉的含藥血清及溶媒血清，保存?zhèn)溆谩?/p>

取ES細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，采用DMEM完全培養(yǎng)液[100 mL DMEM完全培養(yǎng)液內(nèi)含20 mL FBS、1 mL β-ME、1 mL 1%的NEAA、0.1 mL LIF(10 mg·L-1)、1 mL青-鏈霉素(10 000 U·mL-1)和76.9 mL DEME高糖培養(yǎng)基]進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。消化ES細(xì)胞，用DMEM實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液[100 mL DMEM實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液內(nèi)含20 mL FBS、1 mL青-鏈霉素(10 000 U·mL-1)和79 mL DEME高糖培養(yǎng)基]配成單細(xì)胞懸液，以每孔500個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，分為溶媒對(duì)照組、半夏粉組及姜半夏粉組，分別加入含有20%相應(yīng)血清的DMEM實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液，終體積為 100 μL，每組設(shè)6個(gè)平行孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，于濕度95%、5%CO2、37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心后吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min顯色。待沉淀完全溶解后，于630 nm波長(zhǎng)[24]處測(cè)定吸光度值(optical density，OD)。

3 結(jié)果

3.1 半夏及姜半夏的顯微特征顯微鏡下對(duì)半夏粉及姜半夏粉進(jìn)行鑒定觀察，發(fā)現(xiàn)半夏粉具有針型結(jié)構(gòu)；經(jīng)過(guò)炮制的姜半夏粉中未發(fā)現(xiàn)針型結(jié)構(gòu)。提示：半夏經(jīng)過(guò)炮制后，化學(xué)成分發(fā)生變化。見(jiàn)圖1。

注：A：半夏粉；B：姜半夏粉圖1 半夏粉、姜半夏粉顯微特征觀察(×100)

3.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果半夏粉組、姜半夏粉組部分小鼠出現(xiàn)豎毛狀態(tài)，半夏粉組小鼠豎毛出現(xiàn)最早時(shí)間為給藥6 h 58 min后，而姜半夏粉組動(dòng)物豎毛出現(xiàn)最早時(shí)間為給藥6 h 44 min后，未見(jiàn)其他異常表現(xiàn)。給藥2 d后，小鼠恢復(fù)正常，未見(jiàn)其他異常表現(xiàn)。14 d內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡。對(duì)各組小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的體質(zhì)量均持續(xù)增長(zhǎng)；與溶媒對(duì)照組比較，給藥后第3天、第7天和第14天，給藥組雄性小鼠的體質(zhì)量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥后第3天、第7天和第14天，半夏粉組雌性小鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.001、P<0.001、P<0.01)；給藥后第3天，姜半夏粉組雌性小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。小鼠處死后進(jìn)行解剖觀察發(fā)現(xiàn)，各組小鼠臟器均未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)表4，表5。

表4 急性毒性實(shí)驗(yàn)中小鼠豎毛情況結(jié)果比較 只)

表5 急性毒性實(shí)驗(yàn)中小鼠體質(zhì)量變化情況比較

3.3 日本大耳白兔眼部刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果與溶媒對(duì)照組比較，半夏粉組兔眼部刺激評(píng)分顯著升高(P<0.001)，姜半夏粉組兔眼部刺激評(píng)分無(wú)明顯變化。提示，半夏粉對(duì)兔眼部具有刺激性，而姜半夏粉無(wú)刺激性。見(jiàn)表6，圖2。

圖2 各組各時(shí)間點(diǎn)兔眼部刺激結(jié)果圖片

表6 各組日本大耳白兔眼部刺激評(píng)分比較 分)

3.4 金黃地鼠口腔黏膜刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與溶媒對(duì)照組比較，半夏粉組金黃地鼠口腔黏膜刺激評(píng)分顯著升高(P<0.001)，而姜半夏粉組金黃地鼠口腔黏膜刺激評(píng)分無(wú)明顯變化。提示，半夏粉對(duì)金黃地鼠口腔黏膜具有刺激性，姜半夏粉無(wú)刺激性。見(jiàn)表7，表8。

表7 給藥3 d內(nèi)各組金黃地鼠口腔黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分結(jié)果比較 分)

表8 給藥4～7 d內(nèi)各組金黃地鼠口腔黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分結(jié)果比較 分)

3.5 小鼠生殖毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與溶媒對(duì)照組比較，半夏粉組及姜半夏粉組孕鼠體質(zhì)量、懷孕數(shù)、仔鼠總數(shù)、發(fā)育正常數(shù)、平均子宮連胎質(zhì)量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表9，表10。

表9 各組孕鼠體質(zhì)量的比較

表10 各組小鼠生殖毒性結(jié)果比較

3.6 含藥血清對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞體外增殖的影響與溶媒對(duì)照組比較，在波長(zhǎng)為630 nm處，各組細(xì)胞的吸光度均未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。提示，半夏粉、姜半夏粉含藥血清對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞體外增殖均無(wú)影響。見(jiàn)表11。

表11 含藥血清對(duì)ES細(xì)胞體外增殖的影響

4 討論

中藥炮制是按要求將中藥材進(jìn)行加工，可降低或消除藥材的毒副作用，改變藥材的性味、功效和臨床療效等[29]。本研究采用最大給藥量法進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，小鼠灌胃半夏及姜半夏后，均出現(xiàn)豎毛、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢的毒性反應(yīng)。根據(jù)《毒理學(xué)教程》(第三版)提示，半夏粉及姜半夏粉的毒性可能涉及動(dòng)物的自主神經(jīng)，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)一系列毒性作用。但與半夏粉組比較，姜半夏粉組動(dòng)物體質(zhì)量恢復(fù)較快，說(shuō)明經(jīng)炮制后，姜半夏毒性降低。但急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅作為參考，并不能對(duì)半夏、姜半夏的毒性作用進(jìn)行完整的闡釋，因此需結(jié)合其他毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。兔眼部刺激性實(shí)驗(yàn)與金黃地鼠口腔黏膜刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，半夏對(duì)兔眼部及金黃地鼠口腔黏膜均有明顯的刺激性，而姜半夏卻沒(méi)有，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，炮制以后姜半夏的毒性有所降低。對(duì)半夏和姜半夏的粉末進(jìn)行顯微鑒別發(fā)現(xiàn)，半夏粉中出現(xiàn)了大量針晶結(jié)構(gòu)，而姜半夏粉中未發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)，與已有研究結(jié)果一致[30]，推測(cè)半夏的刺激性主要是針晶結(jié)構(gòu)的化合物導(dǎo)致的，但半夏針晶結(jié)構(gòu)化合物導(dǎo)致刺激性的原因還不清楚，后續(xù)將對(duì)此進(jìn)行深入研究。

國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(the International council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use，ICH)推薦的生殖毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是對(duì)整體動(dòng)物進(jìn)行的毒理實(shí)驗(yàn)，即三段實(shí)驗(yàn)，包括一般生殖毒性實(shí)驗(yàn)(Ⅰ)、圍產(chǎn)期生殖毒性實(shí)驗(yàn)(Ⅱ)、致畸敏感期生殖毒性實(shí)驗(yàn)(Ⅲ)。三段實(shí)驗(yàn)需大量動(dòng)物且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，難以迅速對(duì)大量物質(zhì)進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，亦不符合減少(reduction)、替代(replacement)和優(yōu)化(refinement)的“3R”原則。本研究中采用小鼠生殖毒性實(shí)驗(yàn)，與三段實(shí)驗(yàn)比較，花費(fèi)少，操作簡(jiǎn)單，能觀察到胚體-胎體毒性(致畸實(shí)驗(yàn))，評(píng)價(jià)重點(diǎn)均為胚胎毒性，但對(duì)生育力和早期胚胎發(fā)育毒性及圍產(chǎn)期毒性無(wú)法覆蓋。20世紀(jì)90年代末，歐洲替代方法研究中心(European centre for the validation of alternative methods，ECVAM)所推薦的胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(embryonic stem cell，EST)、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(embryonic cell micromass culture，MM)及體外全胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(whole embryo culture，WEC)可作為體外胚胎發(fā)育毒性篩選實(shí)驗(yàn)的替代方法[31]。因此，本研究采用小鼠生殖毒性實(shí)驗(yàn)及含藥血清對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的體外增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步生殖毒性研究，結(jié)果顯示，半夏及姜半夏均不具有生殖毒性，與其他研究者結(jié)果不一致[32]，可能是由于半夏及姜半夏的劑量不同所致，且本研究中采用的初步生殖毒性研究?jī)?nèi)容較少，無(wú)法全面覆蓋生殖及遺傳毒性研究。因此，后續(xù)需采用生殖毒性三段實(shí)驗(yàn)、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)及胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體外全胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)生半夏及姜半夏的安全性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件及所設(shè)計(jì)的劑量下，半夏粉對(duì)兔眼部黏膜、金黃地鼠口腔黏膜均具有刺激性，但不具生殖毒性，而姜半夏無(wú)刺激性亦無(wú)生殖毒性，說(shuō)明半夏經(jīng)炮制后毒副作用降低或消除。后續(xù)將對(duì)半夏及姜半夏的毒理、毒性進(jìn)行進(jìn)一步研究，并對(duì)其藥理學(xué)作用進(jìn)行對(duì)比研究，進(jìn)一步探討炮制的增效減毒作用，為半夏及其炮制品臨床使用的安全性、有效性提供科學(xué)依據(jù)。