趙汗青，張群秀，王文娟

（首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069）

腫瘤相關性貧血（cancer related anemia,CRA）為惡性腫瘤常見伴隨疾病之一，是腫瘤患者在疾病發(fā)展及治療過程中發(fā)生的貧血。臨床主要表現(xiàn)為紅細胞數及壓積下降，血紅蛋白濃度降低?；颊呖沙霈F(xiàn)疲乏、頭暈、食欲減退、消化不良、呼吸困難等癥狀。國內外研究表明，腫瘤患者貧血發(fā)生率為30%～90%[1-2]。貧血不僅對腫瘤患者的體能、精神狀態(tài)和生活質量產生影響，還可引起腫瘤組織乏氧從而影響放化療效果[3]，導致腫瘤耐藥[4]，促進腫瘤轉移[4]，增加患者死亡風險。據報道，腫瘤伴貧血患者的平均生存期可縮短20%～43%[5]。因此，貧血已成為腫瘤的一個獨立預后不良因素[6]。

目前臨床改善貧血的方法主要有治療潛在病因、輸注紅細胞、補充鐵劑、使用紅細胞刺激因子等[7]，然而諸方法均存在一定的局限，導致抗貧血治療尚不能達到滿意的療效。中醫(yī)藥改善貧血多從健脾補腎、益氣養(yǎng)血入手，具有療效穩(wěn)定、副作用小等優(yōu)勢[8]。為進一步闡明補腎生血法改善貧血的機制，本研究采用具有紅系分化潛能的人髓性紅白血病K562細胞為模型，以補腎生血法代表方左歸丸血清進行干預，通過檢測細胞增殖、紅系分化相關指標，明確其調控紅系分化的機制，以期為臨床有效防治腫瘤相關性貧血提供實驗依據。

1 材 料

1.1 實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠16只，體質量（250±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物合格證號：110011191 1018409。將大鼠飼養(yǎng)在屏障級動物室，采用12 h循環(huán)照明，溫度（25±1）℃，濕度70%，自由攝食、飲水，適應性飼養(yǎng)3 d。本研究經首都醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，倫理編號：AEEI-2017-036。

1.2 細胞株K562細胞株（北京泰科蘭博科技有限公司）。

1.3 藥物與試劑 左歸丸，方藥組成：熟地黃24 g，炒山藥12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，川牛膝9 g，菟絲子12 g，鹿角膠12 g，龜甲膠12 g，上述中藥飲片購自北京同仁堂藥店。

RPMI 1640不完全培養(yǎng)液（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KG023945）；胎牛血清（上海碧云天生物技術有限公司，批號：011717170405）；Cell Counting Kit-8試劑盒（日本同仁，批號：FH783）；瑞氏-吉姆薩復合染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180201）；FITC anti-human CD71（BioLegend，批號：B253417）；FITC Mouse IgG2a,k Isotype Ctrl（BioLegend，批號：B269543）；Cell Staining Buffer（BioLegend，批號：B264524）；GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb（美國CST，批號：#5174）；GATA-1（D52H6）XP Rabbit mAb（美國CST，批號：#3535）；Anti-rabbit IgG HPR-linked Antibody（美國CST，批號：#7074）；Simply P總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司，批號：C528H1a）；Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：#R7025）；SuperReal熒光定量預混試劑增強版（北京天根生化科技有限公司，批號：#R6620）。

1.4 主要儀器 定制型BD LSRFortessa SORP流式細胞分析儀（BD公司）；DM6000B型正置熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（Leica公司）；iD3型多功能基因蛋白檢測儀（SpectraMax公司）；FUSION FX6 XT型凝膠化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（VIVILBER公司）；CFX96型熒光定量PCR儀（BIO-RAD公司）。

2 方 法

2.2 K562細胞分組、干預K562細胞培養(yǎng)于含RPMI 1640、10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對數生長期細胞，接種于培養(yǎng)板中，隨機分為空白對照組、空白血清組、陽性對照組、左歸丸血清組?？瞻讓φ战M：在50%RPMI 1640完全培養(yǎng)基的基礎上，加入50% RPMI 1640基礎培養(yǎng)基；空白血清組：在50%RPMI 1640完全培養(yǎng)基的基礎上，加入30% RPMI 1640基礎培養(yǎng)基、20%空白血清；陽性對照組：在50%RPMI 1640完全培養(yǎng)基的基礎上，加入49%RPMI 1640基礎培養(yǎng)基、1% 50 mmol/L丁酸鈉溶液；左歸丸血清組：在50%RPMI 1640完全培養(yǎng)基的基礎上，加入30%RPMI 1640基礎培養(yǎng)基、20%左歸丸血清。于培養(yǎng)箱中孵育48 h后收集細胞。

2.3 CCK8檢測左歸丸血清對細胞增殖活性的影響 取對數生長期細胞，調整密度為5×104個/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中。分別加入5%、10%、15%、20%、25%左歸丸血清，同時設空白對照組（無含藥血清），每組3個復孔，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標儀450 nm波長處測定OD值。

2.4 瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài) 取對數生長期細胞，調整密度為4×105個/mL，按1 mL/孔接種于6孔板中，加藥孵育48 h后收集細胞。離心去上清，PBS清洗2次，加PBS緩沖液50 μL重懸細胞。取10 μL細胞懸液滴在多聚賴氨酸黏附載玻片上，制成細胞涂片。涂片用4%多聚甲醛固定30 min，滴加瑞氏-吉姆薩染液，光鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.5 光鏡下計數聯(lián)苯胺藍染細胞陽性率 取對數生長期細胞，調整密度為4×105個/mL，按1 mL/孔接種于6孔板中，每組3個復孔，加藥孵育48 h后收集細胞。離心去上清，PBS清洗2次，加PBS緩沖液400 μL重懸細胞。聯(lián)苯胺染液和30%H2O2以50∶1混合，于96孔板中加9 μL染液和81 μL細胞，混合均勻，室溫靜置5 min。顯微鏡下計數200個細胞，計算藍染細胞陽性率（%）。

2.6 酶標儀檢測血紅蛋白含量 取對數生長期細胞，調整密度為4×105個/mL，按1 mL/孔接種于6孔板中，每組3個復孔，分別加藥孵育24、48 h后收集細胞。4℃1 000 r/min離心10 min，去上清液。PBS清洗1次，去上清。細胞中加入70 μL聯(lián)苯胺溶液、70 μL 1%H2O2，混勻，4℃避光染色30 min，加入10%乙酸700 μL。按200 μL/孔加入96孔板中，酶標儀490 nm波長處測定OD值。

2.7 流式細胞儀檢測CD71表達情況 取對數生長期細胞，調整密度為4×105個/mL，按1 mL/孔接種于6孔板中，在原分組基礎上增加ISO同型對照，每組3個復孔。加藥孵育24 h后收集細胞，離心去上清。用Cell Staining Buffer清洗2次，去上清。ISO組加入0.4 μL Isotype、99.6 μL Cell Staining Buffer，其余組分別加入2 μL CD71抗體、98 μL Cell Staining Buffer，4℃避光靜置15 min。用Cell Staining Buffer清洗2次，去上清液。加入500 μL Cell Staining Buffer重懸細胞，上流式細胞儀檢測細胞表面CD71熒光強度，分析CD71表達率（%）。

1990年新年，憨豆先生再次出現(xiàn)。原本這僅僅是一次喜劇表演。但該角色取得了成功，20世紀90年代，艾金森又拍攝了多部續(xù)集。最終，該劇被制作成為電影，艾金森從此成為國際影星。他的視覺喜劇風格讓他獲得了“帶著橡皮臉的男人”的昵稱。

2.8 Western blotting檢測GATA-1蛋白表達情況 取對數生長期細胞，調整密度為1×106個/mL，按2 mL/孔接種于6孔板中，設6個復孔。加藥孵育48 h后收集細胞，離心去上清，PBS洗2次。加入裂解液充分裂解，提取總蛋白。BCA試劑盒測蛋白濃度，調整蛋白濃度為2 μg/μL。蛋白上樣量20 μg，依次電泳、轉膜、封閉。加入目的蛋白GATA-1一抗（用TBST以1∶1 000稀釋）5 mL和內參蛋白GAPDH一抗（用TBST以1∶1 000稀釋）5 mL，4℃孵育過夜，洗膜；加入二抗（用TBST以1∶1 000稀釋）5 mL；洗膜，ECL發(fā)光采集圖像。采用Image J軟件計算條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算GATA-1蛋白相對表達量。

2.9 Real-time PCR檢測GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達情況 取對數生長期細胞，調整密度為1×106個/mL。按1 mL/孔接種于6孔板中，設7個復孔。加藥孵育48 h后收集細胞，2 500 r/min離心4 min，去上清，PBS洗2次。按照試劑盒操作提取總RNA，反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR擴增。引物設計序列見表1。采用20 μL反應體系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.6 μL，2×Super Real Pre Mix Plus 10 μL，RNase-Free dd H2O 6.8 μL。擴增條件：95℃15 min預變性，95℃10 s變性，60℃20 s退火，72℃32 s延伸，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算K562細胞中促紅細胞生成素（EPO）、促紅細胞生成素受體（EPOR）、紅系特異性轉錄因子-1（GATA-1）的mRNA相對表達量。

表1 引物設計

2.10 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布者采用“均數±標準差”（±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 左歸丸血清不同濃度、干預時間對K562細胞增殖活性的影響 干預24、48、72 h，左歸丸血清在5%～20%濃度范圍內均存在著明顯的量效關系，且隨著左歸丸血清濃度增加，K562細胞增殖活性逐漸降低。經統(tǒng)計分析，與空白血清組比較，各濃度左歸丸血清組K562細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.05）。其中20%左歸丸血清作用24 h和48 h抑制K562細胞增殖活性的效果最佳（P＜0.01）。（見圖1）

圖1 各組K562細胞增殖活性比較（n=3）

3.2 各組K562細胞形態(tài)比較 干預48 h，空白對照組K562細胞呈圓形，胞核較大，胞漿較少，核漿比較大；空白血清組和陽性對照組K562細胞呈圓形，胞核較大，胞漿較少，核漿比較大，與空白對照組差別不大；左歸丸血清組與其他3組比較，細胞染色質固縮，胞核明顯變小，胞漿豐富，核漿比降低。（見圖2）

圖2 各組K562細胞光鏡形態(tài)比較（×1 000）

3.3 各組K562細胞血紅蛋白含量比較 干預24 h，空白血清組、陽性對照組、左歸丸血清組K562細胞血紅蛋白含量均明顯高于空白對照組（P＜0.01）；陽性對照組K562細胞血紅蛋白含量低于空白血清組（P＜0.01）；左歸丸血清組K562細胞血紅蛋白含量明顯高于陽性對照組（P＜0.01）。

干預48 h，空白血清組、左歸丸血清組K562細胞血紅蛋白含量均明顯高于空白對照組（P＜0.01）；陽性對照組K562細胞血紅蛋白含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；陽性對照組K562細胞血紅蛋白含量低于空白血清組（P＜0.01）；左歸丸血清組血紅蛋白含量明顯高于陽性對照組（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 各組K562細胞血紅蛋白含量比較（x±s，n=3）

3.4 各組K562細胞血紅蛋白表達陽性率比較 干預48 h，空白血清組、左歸丸血清組K562細胞血紅蛋白表達陽性率均明顯高于空白對照組（P＜0.01）；陽性對照組K562細胞血紅蛋白表達陽性率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；陽性對照組K562細胞血紅蛋白表達陽性率明顯低于空白血清組（P＜0.01）；左歸丸血清組K562細胞血紅蛋白表達陽性率明顯高于陽性對照組（P＜0.01）。（見圖4）

圖4 各組K562細胞血紅蛋白表達陽性率比較

3.5 各組K562細胞紅系分化標志CD71表達率比較 干預24 h，空白對照組表達CD71的K562細胞大多數小于103，空白血清組表達CD71的K562細胞平均分布于103兩側，陽性對照組表達CD71的K562細胞大多數小于103，左歸丸血清組表達CD71的K562細胞大多數大于103?？瞻讓φ战M、空白血清組、陽性對照組K562細胞CD71表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸丸血清組K562細胞CD71表達率明顯高于空白對照組、空白血清組、陽性對照組（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖5）

圖5 各組K562細胞CD71表達率比較

3.6 各組K562細胞紅系分化相關蛋白GATA-1表達比較 干預48 h，與空白對照組比較，空白血清組、陽性對照組、左歸丸血清組K562細胞GATA-1蛋白表達均明顯上調（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖6）

圖6 各組K562細胞GATA-1蛋白表達比較

3.7 各組K562細胞紅系分化相關基因GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達比較 干預48 h，空白對照組、空白血清組、陽性對照組K562細胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸丸血清組K562細胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達均明顯高于空白對照組、空白血清組和陽性對照組（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖7）

圖7 各組K562細胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達比較

4 討 論

腫瘤相關性貧血可造成患者預后較差，嚴重影響生存質量，是臨床迫切需要解決的問題[2]。其發(fā)生機制主要是紅細胞生成不足、破壞過多及失血[7]。原因主要有腫瘤所致貧血、腫瘤治療相關性貧血、營養(yǎng)素缺乏所致貧血[8]。目前西醫(yī)治療貧血尚未達到滿意效果，因此需積極尋找有效治療手段。調控紅系分化是近年抗貧血研究熱點。紅系分化是造血干細胞增殖、分化、發(fā)育為成熟紅細胞的過程，該過程受細胞內多種基因和細胞因子調控，其中關鍵因素有EPO、EPOR、GATA-1等[9-11]。有研究報道，龜甲、丹參、黨參、黃芪等中藥，人參多糖、人參總皂甙、苦參堿、藤黃酸、甘草次酸等中藥成分可促紅系分化[12-18]。

中醫(yī)學認為腫瘤相關性貧血患者常見面色少華、神疲乏力、頭暈耳鳴、心悸失眠、食欲減退、舌淡暗、苔薄白、脈細弱無力等，基本病機為氣血兩虛，而其重要病機是脾腎虧虛、精血化生乏源[8]。腎藏精生髓，精血互化，髓能養(yǎng)血，因此補腎可促進血液化生。臨床報道已證實[19-21]，采用補腎生血治療貧血能取得明顯的臨床療效。左歸丸由熟地黃、枸杞子、山茱萸、龜甲膠、鹿甲膠、牛膝、菟絲子、山藥組成，可補腎養(yǎng)陰、填精益髓，臨床上多用來聯(lián)合西藥治療再生障礙性貧血，有研究顯示其療效優(yōu)于單純西藥組[22-23]；沈輝等[24]采用左歸丸合當歸補血湯治療化療后骨髓抑制，療效也明顯優(yōu)于對照組。研究[25]顯示，左歸丸中熟地黃、山萸肉、枸杞子、菟絲子、鹿角膠、龜甲等藥均為臨床治療腫瘤相關性貧血常用藥，但作用機制尚不明確。

本實驗采用左歸丸作為補腎生血法代表方，以具有分化潛能的紅白血病K562細胞為模型，從紅系分化角度進行機制研究。實驗結果顯示：左歸丸血清干預24、48、72 h對K562細胞增殖具有顯著抑制作用（P＜0.05），在5%～20%濃度范圍內呈現(xiàn)出明顯的量效關系；細胞涂片瑞氏-吉姆薩染色顯示，左歸丸血清干預后細胞染色質固縮，胞核變小，胞漿豐富，核漿比降低，呈現(xiàn)出成熟細胞的特點。20%左歸丸血清作用24 h和48 h抑制細胞增殖的效果最佳（P＜0.01），且干預48 h的作用尤為突出，因此實驗時間選擇48 h或者24 h。

血紅蛋白是紅系標志之一，聯(lián)苯胺可與血紅蛋白發(fā)生反應而呈藍色，鏡下可見細胞藍染，采用酶標儀可定量檢測血紅蛋白含量。K562細胞是未分化的原始細胞，血紅蛋白含量較低。實驗結果顯示，左歸丸血清干預后，K562細胞中表達血紅蛋白的陽性細胞率明顯上升，血紅蛋白含量也明顯增加（P＜0.01）。

CD71為轉鐵蛋白受體，與轉鐵蛋白結合后可介導細胞內鐵攝取。隨著造血干/祖細胞向紅系分化，承擔鐵運輸作用的血紅蛋白合成逐漸增加，因此CD71表達逐漸升高，故CD71可作為紅系分化標志。本實驗結果顯示，左歸丸血清能明顯升高K562細胞CD71表達率（P＜0.05），而CD71僅在24 h差異顯著，48 h卻差異不大，是否存在對于CD71的調節(jié)僅表現(xiàn)在24 h，原因仍待探究。

EPO為紅系特異性細胞因子，與EPOR結合后可激活JAK-STATs、Ras等信號通路而刺激紅系造血。在紅系造血過程中，EPO首先誘導GATA-1、EPOR表達[9]。EPOR基因啟動子中存在著特異性GATA-1結合元件，GATA-1與該元件結合后能激活轉錄EPOR基因，增加紅系細胞對EPO的反應性[10]。GATA-1能特異性激活多種紅系基因，誘導細胞向紅系分化，促進紅細胞發(fā)育成熟，并隨紅系分化成熟而上調[11]?？梢奊ATA-1、EPO、EPOR之間存在著密切聯(lián)系，共同促進紅系分化。實驗結果顯示，左歸丸血清可顯著上調K562細胞中GATA-1蛋白表達（P＜0.01），同時還明顯上調GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達（P＜0.01或P＜0.05）。

綜上所述，左歸丸血清可促進K562細胞向紅系分化，其機制與調控GATA-1、EPO、EPOR表達有關。左歸丸血清對K562細胞GATA-1 mRNA、EPO mRNA、EPOR mRNA表達均有明顯上調作用，對GATA-1的蛋白表達也有明顯上調作用，對EPO和EPOR蛋白表達的影響尚不明確，這是下一步實驗的研究方向。由于血清成分較復雜，目前尚不能明確是左歸丸本身的藥效作用，還是左歸丸與血清的協(xié)同作用誘導K562細胞向紅系分化，因此還需今后進一步從血清藥理學角度開展深入研究。