肖永琴，張 珂，曹靜平

（1.四川省腫瘤醫(yī)院，四川 成都 610041；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400000）

目前，胃癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，因早期診斷率較低，且總體上預(yù)后較差，所以胃癌的發(fā)病率高、死亡率高[1]。已有研究表明，中醫(yī)藥能夠通過調(diào)節(jié)多個(gè)信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡[2-3]。因此研究中醫(yī)藥治療胃癌具有重要意義。

虎杖苷（polydatin，PD）是從虎杖的干燥根莖中提取的單體成分，也可在多種植物中被提取。藥理研究表明，虎杖苷具有抗炎[4]、抗過敏[5]、抗腫瘤[6]的功效?；⒄溶盏目鼓[瘤作用已在多種腫瘤中證實(shí)，例如鼻咽癌[7]、肺癌[8]、乳腺癌[9]等。本研究以人胃癌SGC-7901為研究對象，探究虎杖苷通過調(diào)節(jié)miR-301a表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步研究抗腫瘤藥物靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901（CL-0206）、人正常胃上皮細(xì)胞GES-1（CL-0563）購于武漢普諾賽生命科技有限公司，用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 虎杖苷（polydatin，批號：HY-N0120A，純度為98.95%，美國Med Chem Express公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640（貨號：PM150110，上海雅吉生物科技有限公司）；青鏈霉素（貨號：30-004-ci，corning公司）；胎牛血清（貨號：abs972，上海優(yōu)寧維生物科技有限公司）；胰蛋白酶（貨號：T4049，Sigma公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR037A）、熒光定量PCR檢測試劑盒（貨號：DRR096A）（大連寶生物工程有限公司）；Lipo6000 TM轉(zhuǎn)染試劑（貨號：C0526）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：C1062M）、CCK8試劑盒（貨號：C0038）（碧云天生物科技有限公司）；GAPDH（貨號：AF5009，小鼠單抗，碧云天生物科技有限公司）；Survivin抗體（貨號：ab469，兔多抗）、Bcl-2抗體（貨號：ab59348，兔多抗）、Bax抗體（貨號：ab182733，兔單抗）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號：ab205718）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）（貨號：ab6789）（abcam公司）；miR-301a及NC-mimics由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 主要儀器Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CFX Connect型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；ZE5型流式細(xì)胞儀（美國Bio-Rad公司）；Micro21R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞（密度為2×105）接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分組為：（1）對照組、miR-301a mimics組、NC mimics組；（2）對照組、虎杖苷組、虎杖苷+miR-301a mimics組、虎杖苷+NC mimics組。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，分別用100μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋5μL Lipo6000 TM轉(zhuǎn)染試劑和100 pmol轉(zhuǎn)染物，室溫靜置5 min，然后混合，在室溫靜置5 min。將該混合物均勻滴加到孔內(nèi)，輕輕混勻。8 h后更換完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

2.2 CCK8實(shí)驗(yàn) 取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞（密度為5×103）接種于96孔板中，具體分組為：（1）對照組、50μmol/L虎杖苷組、100μmol/L虎杖苷組、150μmol/L虎杖苷組；（2）虎杖苷組、虎杖苷+miR-301a mimics組、虎杖苷+NC mimics組。進(jìn)行不同濃度的虎杖苷處理或轉(zhuǎn)染NC/miR-301a mimics后，培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔中加入20μL CCK8試劑，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后使用酶標(biāo)儀測定其450 nm處吸光度值。

2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)TRIzol Reagent使用說明書提取人SGC-7901和GES-1細(xì)胞中的總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（95℃5s，60℃20 s）。以U6為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計(jì)算miR-301a的相對表達(dá)量。具體引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取處于生長期的SGC-7901細(xì)胞至6孔板中，具體分組為：（1）NC組、50μmol/L虎杖苷組、100μmol/L虎杖苷組、150μmol/L虎杖苷組；（2）虎杖苷組、虎杖苷+miR-301a mimics組、虎杖苷+NC mimics組。進(jìn)行不同濃度的虎杖苷處理或NC/miR-301a mimics轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。然后用0.25%胰酶對人SGC-7901細(xì)胞消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。然后加入500μL的1×binding buffer對細(xì)胞進(jìn)行重懸，加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI并輕輕搖晃混勻，室溫避光孵育10 min，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，并計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

2.5 Western blotting實(shí)驗(yàn) 取處于生長期的SGC-7901細(xì)胞至6孔板中，進(jìn)行處理或轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并使用細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制濃縮膠和分離膠，取25μg蛋白進(jìn)行上樣，采用恒壓進(jìn)行電泳，然后濕轉(zhuǎn)至PDVF膜上。使用5%的脫脂奶粉對膜封閉1 h。加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000），4℃過夜孵育，1×PBST清洗3次。加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，1×PBST清洗3次。在膜上逐滴加入ECL顯影液進(jìn)行顯影，并通過Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graph Pad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均用（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較則采用t檢驗(yàn)。3組及3組以上數(shù)據(jù)間的比較先采用單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)確定具有顯著差異時(shí)，再進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。以P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 虎杖苷對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，虎杖苷在不同時(shí)間梯度處理后，對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力均有一定程度的抑制作用，具有一定的時(shí)間依賴性。虎杖苷在不同濃度梯度處理后，細(xì)胞增殖速率減緩具有一定的劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。為此選用150μmol/L虎杖苷處理48 h進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。（見圖1A）

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，虎杖苷處理后，人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率增加，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。（見圖1B）

圖1 虎杖苷對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3.2 虎杖苷對胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-301a表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與人正常胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞比較，miR-301a在人胃癌SGC-7901細(xì)胞中高表達(dá)（P〈0.05）。（見圖2A）與對照組比較，在人胃癌SGC-7901細(xì)胞中使用虎杖苷處理后miR-301a表達(dá)量降低，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。（見圖2B）

圖2 虎杖苷對胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-301a表達(dá)的影響

3.3 miR-301a過表達(dá)能夠部分消除虎杖苷抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的作用qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-301a mimics組的細(xì)胞中miR-301a表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）；轉(zhuǎn)染NC mimics組中miR-301a表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖3A）與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中miR-301a表達(dá)增加（P〈0.01）；而虎杖苷+NC mimics組miR-301a表達(dá)與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖3B）

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力增加（P〈0.05）；而虎杖苷+NC mimics組胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖3C）

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率降低（P〈0.05）；而虎杖苷+NC mimics組中細(xì)胞凋亡率與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖3D）

圖3 miR-301a過表達(dá)能夠部分消除虎杖苷抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的作用

3.4 miR-301a過表達(dá)能夠部分消除虎杖苷抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，虎杖苷處理的胃癌SGC-7901細(xì)胞中survivin、Bcl-2蛋白含量表達(dá)降低（P〈0.05），Bax蛋白表達(dá)增加（P〈0.05）。與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中胃癌SGC-7901細(xì)胞中survivin、Bcl-2蛋白含量增加（P〈0.05），Bax蛋白含量下降（P〈0.05），而虎杖苷+NC mimics組中蛋白表達(dá)與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖4）

圖4 miR-301a過表達(dá)能夠部分消除胃癌SGC-7901細(xì)胞中虎杖苷抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

4 討 論

胃惡性腫瘤起源于胃壁最表層的黏膜上皮細(xì)胞，可發(fā)生于胃的各個(gè)部位[10]。臨床上常應(yīng)用順鉑、紫杉醇、奧沙利鉑等對胃癌進(jìn)行治療，但是具有一定的副作用[11]?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家認(rèn)為臟腑陰陽失調(diào)、氣滯血瘀、肺氣抑郁等是多種癌癥發(fā)生的主要病因[12]。因此，應(yīng)該以扶正培本、清熱解毒、活血化瘀為中醫(yī)藥治療癌癥的基本原則?；⒄溶帐且环N天然活性成分，藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[13-14]。鐘華林等[7]研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷能夠通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路進(jìn)而抑制鼻咽癌DNE-1細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性。本研究結(jié)果顯示不同濃度虎杖苷處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞，能夠抑制SGC-7901細(xì)胞增殖能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且對SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用具有一定的劑量依賴性，提示虎杖苷在胃癌細(xì)胞中具有抗腫瘤作用。

MicroRNA是具有高度保守性的含有22個(gè)核苷酸的內(nèi)源非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs，其能夠與mRNA的3’UTR端相結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控作用[15]。近年來，有研究指出miR-301a是一種參與調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展的致癌基因，但其潛在機(jī)制尚不清楚。有研究表明，miRNA-301a-3p表達(dá)在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中均上調(diào)，且miR-301a-3p的高表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后有關(guān)；抑制miR-301a-3p的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞AGS和MKN-45增殖、遷移和侵襲能力[16]。DOU J等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-301a模擬物可提高胃癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。此外，已有研究證實(shí)虎杖苷可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)水平在癌癥中發(fā)揮抗腫瘤的作用[18]。本研究結(jié)果表明，與人正常胃上皮細(xì)胞相比，miR-301a在胃癌SGC-7901細(xì)胞中高表達(dá)；虎杖苷處理后SGC-7901細(xì)胞中miR-301a降低。當(dāng)過表達(dá)miR-301a及虎杖苷處理后，能夠引起細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，且促凋亡蛋白含量降低，抑凋亡蛋白增加。提示miR-301a表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)虎杖苷對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用并抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，虎杖苷能夠抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其具體機(jī)制可能為虎杖苷通過抑制miR-301a表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，為進(jìn)一步開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。