馮帥華，文 哲，姚紅艷，姚順騫，張 淼，吳官保

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湘潭市中醫(yī)院，湖南 湘潭 411100）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）又稱退行性膝骨關(guān)節(jié)炎，是一種最常見的退行性關(guān)節(jié)病，我國(guó)目前KOA的患病率約為18%，并且有逐年增加趨勢(shì)，女性多于男性[1]。目前KOA的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但具有相似的病理學(xué)改變，主要為進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞甚至缺損，軟骨下骨囊性變，骨贅形成等特點(diǎn)[2]。目前治療方案大體分為非手術(shù)治療和手術(shù)治療，中醫(yī)在非手術(shù)治療方面有較多的優(yōu)勢(shì)，其中中醫(yī)外用膏劑外敷治療有簡(jiǎn)單、方便并效果顯著的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床。超微腫痛貼是湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院自制中藥外用膏劑，多種研究證實(shí)了其療效。對(duì)此，本研究借助病理學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)手段，研究超微腫痛貼對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔的干預(yù)作用，旨在探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇3月齡普通級(jí)新西蘭實(shí)驗(yàn)兔50只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半，由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)：SYXK（相）2015-0008。經(jīng)檢疫后在湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，單籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案得到湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 超微腫痛貼（含藥量：每100 cm2不少于7.5 g，規(guī)格：9 cm×7 cm）為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑制備室生產(chǎn)，該方主要中藥材成分是：延胡索、大黃、菟絲子、熟地黃、川芎、當(dāng)歸、沒藥、乳香、紅花、蒲黃、姜黃、莪術(shù)、白芷、梔子、香附、冰片。氟比洛芬巴布膏（澤普思，日本三笠制藥株式會(huì)社，國(guó)藥準(zhǔn)字J20100007，批號(hào)：402194，規(guī)格：13.6 cm×10 cm）。木瓜蛋白酶（美國(guó)Genview公司，批號(hào)GX-6024）；蘇木素、伊紅（Wellbio公司，批號(hào)：UDT180015-1）；兔IL-1βELISA試劑盒（批號(hào)：20172011）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)：20171009）（南京森貝伽生物科技有限公司）；MMP-3、CollagenⅡ抗體（美國(guó)proteintech公司，批號(hào)：SA00001-2）；RIPA裂解液（中國(guó)長(zhǎng)沙維世爾生物，批號(hào)：RA19060）；BCA蛋白定量試劑盒（Wellbio公司，批號(hào)：UDT180009-6）。

1.3 主要儀器BA210T顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；YD-315型切片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BMJ-A型包埋機(jī)（常州中威電子儀器）；TS-92型搖床（中國(guó)江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；164-5050型電泳儀及電泳槽（美國(guó)Bio-rad公司）；TGL-18R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DYCZ-40A型轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一生物科技有限公司）；QL-901型漩渦混合器（中國(guó)江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；a85-1型磁力攪拌器（中國(guó)榮華）。

1.4 造模與分組 將50只新西蘭兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（12只）和造模組（38只），造模組新西蘭兔采用膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶的方式復(fù)制兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。方法：刮除后肢右側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍兔毛，微屈膝，由髕韌帶內(nèi)側(cè)緣凹陷處進(jìn)針，將5%木瓜蛋白酶注射到膝關(guān)節(jié)腔，0.1 mL/kg。于第1天、第3天、第5天各注射一次，并常規(guī)飼養(yǎng)4周后，可得到兔膝關(guān)節(jié)炎模型[3]。4周后，從38只造模組新西蘭兔中隨機(jī)抽取2只，采用空氣栓塞法處死，解剖右膝發(fā)現(xiàn)軟骨面暗淡、粗糙，取軟骨標(biāo)本HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，軟骨破壞、潮線欠流暢，提示造模成功。（見圖1）

圖1 造模組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)（HE，×40）

造模成功后將已造模的36只新西蘭兔隨機(jī)分為模型組、氟比洛芬巴布膏組、超微腫痛貼組，雌雄各半，每組12只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 參照Meeh-Rubner法公式計(jì)算兔體表面積，然后用許文生氏公式計(jì)算我國(guó)國(guó)人體表面積，取人體表面積與兔體表面積比值（100∶7）得出兔膝骨關(guān)節(jié)超微腫痛貼用量大小為：2.39 cm×1.86 cm。造模4周后，開始予藥物干預(yù)。超微腫痛貼組兔予超微腫痛貼貼于右側(cè)膝關(guān)節(jié)（為防止撕咬及脫落，予醫(yī)用膠布及繃帶固定，固定后觀察兔的活動(dòng)，以不影響正?；顒?dòng)為標(biāo)準(zhǔn)，防止影響局部血液循環(huán)，并每1 h巡查1次），1次/d，6 h/次，連續(xù)給藥4周。氟比洛芬巴布膏組兔予氟比洛芬巴布膏貼于右側(cè)膝關(guān)節(jié)，用量大小為3.60 cm×2.65 cm，以同樣的固定方法固定藥物，1次/d，6 h/次，連續(xù)給藥4周?？瞻捉M與模型組不進(jìn)行任何干預(yù)，常規(guī)喂養(yǎng)4周。

1.6 取材及處理 治療4周后行空氣栓塞法處死4組兔，取材方法如下：（1）處死后首先在右側(cè)膝關(guān)節(jié)暴露髕上囊，在髕上囊處切開一小口，用注射器灌注滅菌生理鹽水1 mL，灌注后充分活動(dòng)膝關(guān)節(jié)，擠壓并回抽收集關(guān)節(jié)液，上述操作反復(fù)3次，直至收集3 mL關(guān)節(jié)液。經(jīng)離心后取上清液置于-20℃保存。（2）再打開關(guān)節(jié)囊，暴露膝關(guān)節(jié)腔，切斷交叉韌帶，清理半月板。然后離斷關(guān)節(jié)，取右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁進(jìn)行清洗，經(jīng)固定、沖洗、脫鈣、浸蠟、包埋、切片、HE染色等處理后，光鏡下觀察軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)。（3）用刀片切取股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面全層軟骨，并保存在液氮中，以進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 光鏡下觀察軟骨形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行Mankin’s評(píng)分 將軟骨切片進(jìn)行HE染色后，在光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，進(jìn)行Mankin’s評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.7.2 ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6水平 將備好的關(guān)節(jié)液常溫化凍，用ELISA試劑盒嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書檢測(cè)關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6的含量。

1.7.3 Western blotting法檢測(cè)軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá) 取備用的兔膝關(guān)節(jié)軟骨，軟骨組織研磨后，并提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，隨后進(jìn)行電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移到NC膜上；用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，將按照一定比例（MMP-3為1:750，Ⅱ型膠原為1:500，β-actin為1:5 000）稀釋的一抗溶液與膜一起孵育，保存在4℃冰箱中過夜；TBST洗3次后進(jìn)行二抗孵育90 min；隨后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色并曝光，最后將曝光后底片進(jìn)行掃描，用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，若方差不齊者用Tamhane’s T2法，若不滿足正態(tài)性采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變情況 空白組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面平坦，軟骨層無裂紋，細(xì)胞數(shù)量及分布正常，大小正常，潮線無破壞；模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨層較空白組薄，軟骨出現(xiàn)較深裂隙，軟骨表面不平坦，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，或增多呈簇狀分布，潮線不平滑、中斷。氟比洛芬巴布膏組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增多，偶有呈簇狀分布，軟骨表面較模型組平坦，存在較多小裂隙，潮線欠流暢，偶有中斷。超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞常規(guī)分布，軟骨表面相對(duì)平坦，存在小裂隙，潮線欠流。（見圖2）

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)圖（HE，×100）

Mankin’s評(píng)分結(jié)果：模型組、氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分明顯高于空白組（P〈0.05）；氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分明顯低于模型組（P〈0.05）；超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分低于氟比洛芬巴布膏組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見表2）

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分比較（±s，分）

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 評(píng)分結(jié)果空白組 12 0.75±0.45模型組 12 7.03±1.21a氟比洛芬巴布膏組 12 5.19±0.84a b超微腫痛貼組 12 5.08±0.91a b F 113.538 P 0.000

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6含量比較 模型組、氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6的含量明顯高于空白組（P〈0.05）；氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6的含量明顯低于模型組（P〈0.05）；超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6的含量低于氟比洛芬巴布膏組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見表3）

表3 各組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）IL-1β IL-6空白組 12 15.71±3.34 11.76±2.67模型組 12 78.61±11.29a 66.51±10.66a氟比洛芬巴布膏組 12 62.13±11.60a b 53.33±8.14a b超微腫痛貼組 12 60.93±10.81a b c 51.69±9.17a b F 89.649 99.091 P 0.000 0.000

2.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組、氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P〈0.05），Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P〈0.05）；與模型組比較，氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P〈0.05），Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P〈0.05）；與氟比洛芬巴布膏組比較，超微腫痛貼組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3蛋白表達(dá)略下調(diào)，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)略上調(diào)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見圖3、表4）。

圖3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)Western blotting圖

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）MMP-3 Ⅱ型膠原空白組 12 0.17±0.04 0.91±0.13模型組 12 0.58±0.10a 0.25±0.06a氟比洛芬巴布膏組 12 0.47±0.08a b 0.44±0.08a b超微腫痛貼組 12 0.44±0.09a b c 0.46±0.09a b F 55.724 107.382 P 0.000 0.000

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為炎性因子、細(xì)胞合成及代謝因子、激素等與KOA發(fā)病關(guān)系密切[4]。KOA發(fā)病及病情進(jìn)展涉及多種病理生理學(xué)改變，其中包括軟骨細(xì)胞凋亡[5]、炎性因子促炎反應(yīng)[6]、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[7]等因素。其中關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)合成與降解失衡是軟骨變性的重要因素,軟骨基質(zhì)的過度降解、丟失是OA病情進(jìn)展中的共同性特征之一?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是降解其細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶系[8]，其中MMP-3是基質(zhì)溶解素，不僅參與間質(zhì)膠原酶的激活，引起Ⅱ型膠原降解,而且可以激活明膠酶及多種絲氨酸蛋白酶，從而引起瀑布效應(yīng),對(duì)軟骨造成進(jìn)行性破壞[9-10]。炎性細(xì)胞因子與OA也有密切關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)OA病變程度與IL-6、IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子的水平有直接關(guān)系[11-12]。IL-1β不僅可以增加巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)局部炎癥，并促進(jìn)MMPs的表達(dá)，也可介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡[13]。IL-6具有加重關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)、上調(diào)MMPs及刺激破骨細(xì)胞活化等作用[14]。

中醫(yī)古籍中，無膝骨關(guān)節(jié)炎病名，現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)發(fā)病的部位命名為“膝痹”。本病的發(fā)生與多種因素有關(guān)，中醫(yī)認(rèn)為膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病與肝腎虧虛，風(fēng)、寒、濕及瘀血客于局部有關(guān)，最終導(dǎo)致局部氣滯血瘀，經(jīng)脈痹阻不通而發(fā)病。其主要病機(jī)是“虛、瘀、毒”[15]，虛主要是肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)；瘀主要是氣滯血瘀，寒凝瘀滯；毒主要是外來之風(fēng)、寒、濕等邪氣，本病主要以肝腎虛為本，外感邪氣及氣滯血瘀為標(biāo)。在治療痹證上，中醫(yī)根據(jù)辨證，合理運(yùn)用活血化瘀、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎等藥物[16]。中醫(yī)在治療膝骨關(guān)節(jié)炎有較多的優(yōu)勢(shì)，其中中醫(yī)外用膏劑貼敷治療因有方便、顯效的特點(diǎn)，在臨床上廣泛運(yùn)用。

超微腫痛貼是湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院的自制中藥外用膏劑，是蔡光先教授經(jīng)驗(yàn)方“腫痛消”的改革劑型。超微腫痛貼方中延胡索能行血中氣滯，故專治一身上下諸痛，味辛則氣血能潤(rùn)能散，具有活血行氣止痛的功效；方中大黃主取活血逐瘀之功，延胡索與大黃配伍活血祛瘀、行氣止痛，共為君藥；熟地黃及菟絲子配伍主要起補(bǔ)益肝腎之功，當(dāng)歸主起活血止痛之效，兼養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；川芎亦然行氣、又能活血，可行一身之氣，為“血中之氣藥”，并具有祛風(fēng)止痛之效，共為臣藥。香附理氣止痛，紅花、姜黃、蒲黃行血祛瘀，乳香與沒藥兩者配伍加強(qiáng)方中活血行瘀、消腫止痛之功，莪術(shù)破血行氣，白芷散寒止痛，梔子清熱利濕，共為佐藥，可助君藥活血祛瘀、行氣止痛之功；冰片辛香，通諸竅經(jīng)絡(luò)，引諸藥行于經(jīng)脈，為使藥。諸藥合用，共奏活血化瘀、行氣消腫止痛、補(bǔ)益肝腎之功效，可標(biāo)本兼治。現(xiàn)代藥理研究中發(fā)現(xiàn)，方中延胡索及大黃兩味君藥的主要成分有良好的抑制炎性因子表達(dá)[17-18]、鎮(zhèn)痛[19]等效果。課題組在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)超微腫痛貼在治療膝骨關(guān)節(jié)炎中可有效地改善臨床癥狀[20-21]，并且研究中證實(shí)了[22-25]降低P物質(zhì)、OPN、1L-1β、TNF-α為其作用機(jī)制之一。傳統(tǒng)散劑制作的外用膏劑中藥材粒徑大，因此溶出速率、溶出度及吸收率相對(duì)低，而超微腫痛貼運(yùn)用的超微飲片將藥材粒徑降低了幾十至近百倍，一般微粉粒徑控制在1～75μm，在保持傳統(tǒng)中藥固有的藥理化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，提取、濃縮等處理后增加了載藥量、提高了透皮效果，并且增加了藥物有效接觸面積。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中因新西蘭兔的生理特性，膝關(guān)節(jié)液量少，無法達(dá)到直接收取的量，因此采用灌洗采取法[26-27]。氟比洛芬作為臨床上常用的抗炎止痛藥物，以往研究發(fā)現(xiàn)[28]，其有明顯的降低CRP、IL-6、TNF-α等炎性因子的作用，并且在臨床研究多次被證實(shí)，有良好的治療KOA的作用[29-30]。

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，超微腫痛貼及氟比洛芬巴布膏均可減少兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β水平，下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3蛋白表達(dá)，上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷超微腫痛貼可能是通過減少IL-6、IL-1β釋放，抑制MMP-3表達(dá)，上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，這可能為其治療KOA的作用機(jī)制之一，為超微腫痛貼防治KOA提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但超微腫痛貼組方藥物較多，其有效成分及具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)探索證實(shí)。