張曉笛，何麗娟，陳會叢，張瀚濤，靳 冉，夏明鈺

（1.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100079；3.北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司，北京 100079）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中所占比例超過50%，其對內(nèi)分泌治療和常規(guī)靶向藥物治療均不敏感[1]，具有極強(qiáng)的侵襲性，復(fù)發(fā)率高，致死率高，預(yù)后不佳。西黃丸具有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱解毒、消腫止痛的功效，是治療乳巖、肺癰、痰核、瘰癘之名方。多項(xiàng)臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，西黃丸可抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的生長、侵襲和腫瘤組織內(nèi)血管生成，還可通過提高機(jī)體免疫力，逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移[2-5]。目前關(guān)于西黃丸治療三陰性乳腺癌的研究報(bào)道很少，因此，本實(shí)驗(yàn)采用人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435建立三陰性乳腺癌移植瘤模型，觀察西黃丸對腫瘤生長、腫瘤病理形態(tài)學(xué)、腫瘤組織凋亡及相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)的影響，探討西黃丸對MDA-MB-435乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤生長及腫瘤組織凋亡的影響。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物6～8周齡SPF級雌性BALB/c-nu裸鼠40只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號：1140070 0187530，體質(zhì)量16～22 g。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室內(nèi)，日光燈照明，12 h明暗周期，自由飲水、飲食，溫度20～26℃，送風(fēng)6～10次/h，濕度40%～70%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京同仁堂研究院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 藥物與試劑 西黃丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號：15042143）；RNA提取試劑盒（TaKaRa公司，批號：AA2403-1）；RNA PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa公司，批號：AK5701）；Gene Finder TM（至善生物，批號：151217）；TUNEL染色試劑盒（美國羅氏制藥公司，批號：11684817910）。

1.4 主要儀器ST5010型全自動組織切片染色機(jī)（德國Leica公司）；RM2235型石蠟切片機(jī)（德國leica公司）；BX61型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；UV2300型紫外分光光度計(jì)（上海天美）；PCR基因擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；MiniBis ProUV凝膠成像儀（以色列DNR）；水平電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞傳代及培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435置于恒溫培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）采用L15完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3 d傳代一次（細(xì)胞貼壁長至培養(yǎng)瓶的80%～90%）。傳代方法：吸去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用PBS液沖洗后加入0.25%胰蛋白酵消化，待消化完全后，加入L15完全培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞后分裝，每天觀察細(xì)胞生長情況。

2.2 人乳腺癌移植瘤造模方法 吸去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用PBS液沖洗后加入0.25%胰蛋白酶消化，輕柔吹貼壁細(xì)胞，收集所有培養(yǎng)瓶中的單細(xì)胞懸液，置入離心機(jī)中離心（1 200 r/min，5 min），棄上層清液，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板下調(diào)整細(xì)胞密度。在無菌操作臺下用75%酒精消毒接種處皮層，抽取人乳腺癌細(xì)胞懸液0.2 mL，于裸鼠腋部皮下緩慢注射，注射后用消毒棉簽輕壓片刻，待接種處皮膚稍隆起后將裸鼠放回。

2.3 分組及給藥 接種10 d后，剔除5只造模未成功者，將35只乳腺癌荷瘤小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)方法分為模型組，環(huán)磷酰胺組和西黃丸高、中、低劑量組，每組7只。西黃丸高、中、低劑量組荷瘤小鼠灌胃西黃丸，給藥劑量分別為1.8、0.9、0.45 g/kg；環(huán)磷酰胺組荷瘤小鼠灌胃環(huán)磷酰胺，給藥劑量為36 mg/kg，模型組荷瘤小鼠以等體積的純水灌胃，1次/d，給藥體積均為20mL/kg。連續(xù)給藥3周后，將荷瘤小鼠脫頸椎處死，其中西黃丸低劑量組2只和西黃丸中劑量組1只因灌胃嗆死。處死荷瘤小鼠后小心分離腫瘤組織，用游標(biāo)卡尺量取腫瘤長、短直徑，稱質(zhì)量，一半用多聚甲醛固定，一半凍存液氮中備用。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 脾臟指數(shù)檢測 荷瘤小鼠脫頸椎處死后，小心分離腫瘤組織，打開腹腔，剝離脾臟，去除多余脂肪，稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.4.2 腫瘤病理組織形態(tài)學(xué)檢測 將腋下腫瘤組織，放置于多聚甲醛中固定，組織固定2周，將腫瘤組織置于包埋盒中進(jìn)行組織脫水、包埋，制作臘塊。組織臘塊切為3μm厚度貼于病理級玻片上，45℃烤片數(shù)分鐘后進(jìn)行HE染色。中性樹膠封片，鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

山洪災(zāi)害防御預(yù)案的編制堅(jiān)持以人為本的原則，以保障人民群眾生命安全為首要目標(biāo)；堅(jiān)持安全第一，常備不懈，以防為主，防、避、搶、救相結(jié)合；堅(jiān)持因地制宜，突出重點(diǎn)，具有可操作性；堅(jiān)持落實(shí)行政首長防汛責(zé)任制、分級管理責(zé)任制、分部門責(zé)任制和崗位責(zé)任制。

2.4.3 腫瘤病理組織免疫組化檢測 免疫組化檢測方法：石蠟切片常規(guī)脫水，加3%H2O2滅活源性過氧化物活性，加山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，PBS液沖洗后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，拍片，光學(xué)顯微鏡下取圖，采用Image-ProPlus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2.4.4 TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡程度 組織蠟塊制備3μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明、封片，光學(xué)顯微鏡下取圖，采用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各組荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。

2.4.5 RT-PCR方法檢測凋亡基因Bax、Caspase-3和原癌基因Bcl-2的mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳，采用MiniBis Pro凝膠成像分析儀進(jìn)行圖像分析，并用Gelpro32凝膠圖像分析軟件對PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，分別用目的基因/內(nèi)參基因的積分吸光度來表示目的基因的mRNA表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊選用One-Way ANOVA法進(jìn)行各組間比較，方差不齊選用t’檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P〈0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 結(jié) 果

3.1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況 環(huán)磷酰胺組和西黃丸高、中、低劑量組荷瘤小鼠腫瘤體積均低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；環(huán)磷酰胺組和西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量均低于模型組（P〈0.05），西黃丸中劑量組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見表1）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況比較（±s）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況比較（±s）

注：與模型組比較，aP〈0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）體積（mm3）腫瘤質(zhì)量（g）模型組 7 - 433.4±179.9 0.371±0.136環(huán)磷酰胺組 7 0.036 286.4±176.5 0.202±0.124a西黃丸高劑量組7 1.800 343.8±182.1 0.216±0.107a西黃丸中劑量組6 0.900 350.2±204.3 0.283±0.093西黃丸低劑量組5 0.450 358.8±135.8 0.275±0.100

3.2 各組荷瘤小鼠體質(zhì)量、脾臟濕質(zhì)量、脾臟指數(shù)比較5組荷瘤小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）；環(huán)磷酰胺組荷瘤小鼠脾臟濕質(zhì)量和脾臟指數(shù)均低于模型組（P〈0.05），西黃丸中劑量組荷瘤小鼠脾臟濕質(zhì)量和脾臟指數(shù)均高于模型組（P〈0.05）；西黃丸中、高劑量組荷瘤小鼠脾臟濕質(zhì)量和脾臟指數(shù)均高于環(huán)磷酰胺組（P〈0.01），西黃丸低劑量組荷瘤小鼠脾臟濕質(zhì)量和脾臟指數(shù)與模型組和環(huán)磷酰胺組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）。（見表2）

表2 各組荷瘤小鼠體質(zhì)量、脾臟濕質(zhì)量、脾臟指數(shù)比較（±s）

表2 各組荷瘤小鼠體質(zhì)量、脾臟濕質(zhì)量、脾臟指數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，aP〈0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，bP〈0.01

組別 動物數(shù)（只）體質(zhì)量（g） 脾臟濕質(zhì)量（g）脾臟指數(shù)（%）模型組 7 15.14±1.01 0.071±0.011 0.447±0.059環(huán)磷酰胺組 7 15.08±0.91 0.049±0.010a 0.322±0.064a西黃丸高劑量組 7 15.59±0.64 0.082±0.022b 0.523±0.134b西黃丸中劑量組 6 16.06±1.16 0.096±0.028a b 0.606±0.214a b西黃丸低劑量組 5 15.77±0.33 0.068±0.005 0.428±0.026

3.3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態(tài)比較 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞呈彌漫性生長，緊密排列在一起。模型組荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞異型性明顯，腫瘤細(xì)胞體積較大者居多，細(xì)胞核大而深染，核漿比例明顯增大，細(xì)胞核可見病理性核分裂像。環(huán)磷酰胺組和西黃丸高、中、低劑量組荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞異型性較模型組低，腫瘤組織出現(xiàn)壞死區(qū)域，壞死區(qū)伊紅染色呈現(xiàn)無結(jié)構(gòu)顆粒狀。其中環(huán)磷酰胺組荷瘤小鼠腫瘤組織見大量泡沫細(xì)胞形成，瘤周可見淋巴細(xì)胞反應(yīng)。西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞有所退變，殘存的腫瘤細(xì)胞較少，腫瘤細(xì)胞核深染、固縮。（見圖1）

圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織的形態(tài)學(xué)比較（HE，×400）

3.4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的表達(dá)比較TUNEL染色陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色，多集中于胞漿、胞膜及核膜上。模型組荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡表達(dá)不明顯，著色較淺，局部區(qū)域表現(xiàn)為淺黃色，西黃丸低劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡局部表達(dá)明顯，呈弱陽性，西黃丸中、高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡組織表現(xiàn)出棕黃色，范圍廣，呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和西黃丸高、中劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡區(qū)域明顯增加（P〈0.05或P〈0.01）。（見圖2～3）

圖2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況比較（TUNEL染色，×400）

Bax免疫組化法陽性表達(dá)為棕黃色，模型組荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡表達(dá)不明顯，環(huán)磷酰胺組和西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡組織表達(dá)明顯，范圍廣，呈強(qiáng)陽性表達(dá)，與模型組比較，陽性表達(dá)顯著增加（P〈0.01）。（見圖4～5）

圖4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bax蛋白表達(dá)的形態(tài)學(xué)比較（免疫組化，×400）

圖3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

圖5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bax蛋白表達(dá)情況比較（±s）

3.5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡基因Bax mRNA、Caspase-3 mRNA和原癌基因Bcl-2 mRNA比較 與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織Caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯升高（P〈0.05），表明環(huán)磷酰胺和高劑量西黃丸對Caspase-3 mRNA的表達(dá)也有一定的促進(jìn)作用；與模型組比較，環(huán)磷酰胺組及西黃丸各劑量組Bax mRNA均明顯降低（P〈0.05），表明環(huán)磷酰胺及高、中、低劑量西黃丸可顯著下調(diào)Bax基因的比率；與模型組比較，西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯降低（P〈0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組裸鼠瘤體組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況（RT-PCR）

圖7 各組荷瘤小鼠瘤體組織Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較（±s）

4 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定條件下接受刺激信號并受基因調(diào)控的一種自主性、程序性死亡過程[6]，對于細(xì)胞凋亡方面的研究，近些年取得了關(guān)鍵性進(jìn)展。細(xì)胞凋亡涉及到一系列蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用，其中Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白和p53蛋白等在調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著重要角色[7]。Bcl-2家族是一組原癌基因蛋白，包含抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類功能相反的一組蛋白質(zhì)，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族一對相反的調(diào)控因子[8]，Bcl-2存在人體多種形態(tài)的腫瘤組織中，Bax可與Bcl-2蛋白形成異二聚體，中和Bcl-2抗凋亡信號，激活下游凋亡因子，從而促進(jìn)凋亡，二者的比例決定細(xì)胞接受凋亡信號的多少[9]。抑癌基因TP53可由輻射、化學(xué)物質(zhì)、氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的DNA損傷等應(yīng)激反應(yīng)激活，從而轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)多種凋亡蛋白（PUMA、NOXA、Bax等）表達(dá)啟動凋亡，維持機(jī)體基因組的穩(wěn)定性[10]。COX-2可能通過蛋白激酶C（PKC）依賴途徑抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生，有研究顯示COX-2抑制劑可使PG合成減少，從而下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

惡性腫瘤與中醫(yī)所述之“積聚”“癥瘕”較為類似，中醫(yī)理論認(rèn)為本虛標(biāo)實(shí)是癌癥的主要病機(jī)，當(dāng)代醫(yī)家指出癌癥以虛致實(shí)的理論，認(rèn)為氣血虛損及臟腑虛損，導(dǎo)致人體三焦道路、人體經(jīng)絡(luò)失于通暢，進(jìn)而產(chǎn)生諸如痰、瘀、內(nèi)毒及內(nèi)火等病理產(chǎn)物，因此多虛中夾實(shí)[12]。西黃丸作為抗腫瘤的中成藥在臨床上被廣泛使用，有“抗癌第一中成藥”的美譽(yù)。西黃丸中牛黃清熱解毒化痰，為君藥；麝香辛竄通絡(luò)，活血散結(jié)，并助牛黃化痰之力，為臣藥；乳香、沒藥活血祛瘀，消腫止痛，為佐藥；黃米飯養(yǎng)胃，陳酒活血行氣以助藥力，共為使藥，全方合用以達(dá)清熱解毒、和營消腫之功效。西黃丸常用來治療淋巴結(jié)核、乳腺增生、丹毒、皰疹口瘡、多發(fā)性膿腫等疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明西黃丸具有抗腫瘤作用[13-15]。

前期結(jié)果提示西黃丸大鼠含藥血清對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，西黃丸含藥血清對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞凋亡有一定的促進(jìn)作用，并且對三陰性乳腺癌細(xì)胞株的抑制作用更強(qiáng)[16]。本實(shí)驗(yàn)研究在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435在裸鼠腋下注射建立三陰性乳腺癌細(xì)胞株移植腫瘤模型（CDX），西黃丸經(jīng)口灌胃給藥3周后檢測腫瘤質(zhì)量、體積、脾臟指數(shù)、病理學(xué)改變、腫瘤組織凋亡情況及和凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)，以評價(jià)西黃丸治療乳腺癌的作用。

本研究顯示，西黃丸干預(yù)乳腺癌CDX后，西黃丸在一定程度上可以降低乳腺癌CDX腫瘤組織瘤質(zhì)量，對乳腺癌CDX所致的腫瘤生長、演進(jìn)有一定抑制作用。西黃丸灌胃給藥乳腺癌CDX后，腫瘤組織中Bax mRNA和Casepase-3 mRNA的表達(dá)均有所降低，同時(shí)可以下調(diào)腫瘤組織中Bcl-2 mRNA的表達(dá)，經(jīng)TUNEL染色結(jié)果表明西黃丸可以增加腫瘤組織中凋亡區(qū)域的面積，可以誘導(dǎo)腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡，凋亡程度與西黃丸給藥劑量呈正相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示，西黃丸低、中、高劑量組Bax蛋白表達(dá)含量依次增加，而PCR結(jié)果顯示，西黃丸高、中、低劑量組Bax mRNA表達(dá)依次增加，這可能是西黃丸可促進(jìn)Bax mRNA加速翻譯成蛋白，也可能是其他的原因尚需進(jìn)一步研究探索。綜上所述，對腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)環(huán)節(jié)的誘導(dǎo)和調(diào)控可能是西黃丸發(fā)揮抗乳腺癌的重要效應(yīng)機(jī)制。