馮帥華，肖文仲，王國峰，張曉晟，胡桔花，王哲享

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

骨質疏松癥（osteoporosis,OP）[1]是一類以骨組織微結構破壞為特征，造成骨強度下降，最終導致骨折等其他全身性骨病的疾病。隨著老年人口比重的逐年升高，OP已成為各國常見的嚴重危害人們健康的慢性疾病之一[2]，直接或間接影響生活質量。目前西藥在治療骨質疏松癥方面有一定的療效，但同時伴有一定副作用，如長期激素治療可出現(xiàn)凝血功能障礙、高血壓、水腫、子宮內膜癌、乳腺癌等[3-6]。中藥防治OP安全性高、毒副作用小，但目前并沒有公認的中藥制劑。筆者在臨床中運用健步湯治療老年性骨質疏松癥療效滿意，為進一步研究健步湯的作用機制，筆者借助去勢大鼠骨質疏松癥模型，觀察健步湯對去勢大鼠骨質疏松癥模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1的影響，探討其部分作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 44只SPF級6個月齡健康雌性（未交配）SD大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，體質量230～250 g，由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫控制于18～28 ℃，12 h間隔照明，定期消毒和通風。本實驗經(jīng)過湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院倫理委員會審核，批號：倫審（201701）25號。

1.2 實驗藥物 健步湯：龜甲膠、鹿角膠、狗骨、制何首烏、川牛膝、杜仲、鎖陽、當歸、熟地黃、威靈仙各12 g，黃柏、人參、羌活、白芍、白術、附子各9 g，中藥均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供。戊酸雌二醇片（法國DELPHARM Lille S.A.S，藥物批準文號：國藥準字J20080036）。

1.3 主要儀器與試劑 自動脫水機（湖北泰康醫(yī)療設備有限公司），珊頓包埋機（青島方信醫(yī)巧器械有限公司），冰凍切片機（英國珊頓公司），顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司）。Motic6.0圖文分析系統(tǒng)（美國Hologic公司），HOLOGIC4 500A型雙能X線骨密度掃描儀（美國Hologic公司），徠卡病理系統(tǒng)（德國Leica公司）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號：20180614）、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒（批號：20180614）、白細胞介素-1（IL-1）試劑盒（批號：20180614）均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 造模及分組 44只雌性SD大鼠，隨機選取12只作為假手術組，假手術組僅行手術摘取卵巢旁約卵巢大小的脂肪組織，不予切除卵巢和結扎輸卵管，其余32只大鼠全部行雙側卵巢切除。采用國內外公認的雌性大鼠去卵巢3個月可形成絕經(jīng)后骨質疏松病理模型。

造模步驟：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，備皮消毒，取腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm雙背側縱行切口，依次分離進入腹腔，尋找卵巢組織，平鑷將卵巢牽出，嚴密結扎輸卵管及其周圍血管、脂肪組織，完整切除雙側卵巢，沖洗傷口，止血徹底，逐層縫合，關閉腹腔，術后連續(xù)3 d注射青霉素20萬U，預防感染。連續(xù)喂養(yǎng)12周后，假手術組與手術組各隨機處死2只行股骨HE染色鏡下觀察，假手術組切片鏡下可見大量清晰成骨細胞，形態(tài)完整，骨小梁致密，形態(tài)規(guī)則，生長旺盛，排列有序；與假手術組比較，手術組大鼠股骨骨小梁數(shù)量異常減少、粗細不均、排列無序且斷裂明顯。（見圖1）

圖1 兩組大鼠股骨組織的形態(tài)結構（HE，×100）

大鼠剩余40只股骨全部行骨密度（BMD）檢測，結果顯示手術組大鼠股骨BMD顯著低于假手術組（P<0.05），與HE染色結果一致，證明實驗造模成功。（見表1）

表1 假手術組與手術組大鼠股骨BMD 比較（，g/cm2）

表1 假手術組與手術組大鼠股骨BMD 比較（，g/cm2）

造模成功的30只大鼠，按隨機數(shù)字表分為模型組、中藥組和西藥組，每組10只。

1.5 實驗給藥 術后常規(guī)喂養(yǎng)12周，于第13周開始給藥，中藥組及西藥組灌胃每日所需給藥劑量根據(jù)人的臨床劑量（X mg/kg）按照人體和大鼠體表面積比換算：

中藥組大鼠予健步湯灌胃：按其原處方量計算，成人每日劑量174 g即2.48 g/kg生藥，換算成大鼠等效劑量則生藥劑量為2.48 g/kg×6.3＝15.66 g/kg；參考前期動物實驗有效劑量，本實驗取健步湯每日劑量為20 g/kg，1次/d。藥物煎制方法：每次將2劑藥物，共計348 g，分2次煎煮，每次煎煮時間約為30 min，合計加水2 000 mL，合并2次煎液，并濃縮至348 mL，生藥濃度為1 g/mL，每周制備1次，將煎好的中藥真空包裝冷藏保存?zhèn)溆?。西藥組大鼠予戊酸雌二醇片灌胃：按照成人每日給藥劑量1 mg口服，換算成大鼠等效劑量為0.014 mg/kg×6.3＝0.40 mg/kg，1次/d。假手術組、模型組大鼠予等容量生理鹽水灌胃，3mL/次，1次/d。

以上藥物連續(xù)給藥12周后，處死所有大鼠，檢測相關指標。

1.6 觀察指標

1.6.1 骨密度BMD 灌胃12周后將大鼠進行麻醉，仰臥位置于QDR-4500A雙能X線骨密度診斷儀上，測量分析股骨近端干骺端及第4腰椎、第5腰椎BMD。

1.6.2 炎癥因子 分別將受試大鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血2 mL，離心10 min（3 000 r/min）分離血清5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用雙抗夾心法測定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1水平。

1.6.3 骨組織形態(tài)學 將大鼠麻醉處死后取股骨，對股骨標本進行常規(guī)處理后，用生理鹽水沖洗，股骨標本固定于4%的多聚甲醛24 h，然后加入含5.5%EDTA的10%中性福爾馬林溶液進行脫鈣36 h，放置梯度乙醇逐漸脫水、浸蠟、石蠟包埋，正中矢狀面連續(xù)切片，切片厚為5 μm，然后使用蘇木精-伊紅染液進行染色，光鏡下隨機選取兩組骨組織高倍視野拍照，并觀察切面單位視野內的骨小梁、軟骨細胞等，進行組織形態(tài)學觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（）表示。符合方差齊性檢驗時采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 本次實驗過程中4組大鼠狀況良好，行造模手術后1周，由于受麻醉劑及相關器官損傷的影響，進食量稍低，體質量增長無明顯差異。大鼠造模手術切口均在1周內愈合。實驗過程中無大鼠死亡。

2.2 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較 給藥12周后，模型組大鼠腰椎、股骨BMD水平顯著低于假手術組（P<0.05）；中藥組及西藥組大鼠腰椎、股骨BMD顯著高于模型組（P<0.05）；中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠腰椎、股骨BMD 比較（，g/cm2）

表2 各組大鼠腰椎、股骨BMD 比較（，g/cm2）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平均明顯高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；西藥組與中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比較（）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比較（）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 組織形態(tài)學觀察結果 假手術組大鼠股骨切片鏡下可見大量清晰成骨細胞，形態(tài)完整，骨小梁致密，形態(tài)規(guī)則，生長旺盛，排列有序。模型組大鼠股骨切片鏡下可見骨小梁排列疏松，數(shù)量明顯低于假手術組，部分骨小梁出現(xiàn)斷裂及鈣鹽沉積減少等骨質疏松特征性表現(xiàn)。西藥組大鼠股骨切片鏡下可見骨組織結構較模型組完整，骨小梁相對完整，骨小梁較致密，骨小梁間有少量斷裂，形態(tài)相對規(guī)則。中藥組大鼠股骨切片鏡下可見骨組織結構完整,骨小梁較模型組增多明顯，骨小梁間無明顯斷裂,成骨細胞排列整齊，形態(tài)結構規(guī)整，成網(wǎng)狀相連續(xù)，鈣鹽沉積較多。（見圖2）

圖2 各組大鼠股骨骨組織的形態(tài)結構（HE，×100）

3 討 論

骨質疏松癥是以骨密度及骨質量下降、微結構改變等為主要表現(xiàn)，導致骨脆性增加、骨折及全身性骨病發(fā)生的一類與年齡相關的代謝性疾病。臨床上以原發(fā)性骨質疏松癥較為常見，包括Ⅰ型原發(fā)性骨質疏松癥（絕經(jīng)后骨質疏松癥）和Ⅱ型原發(fā)性骨質疏松癥（老年骨質疏松癥）。增齡和不健康生活方式是骨質疏松癥高發(fā)的主要原因[7]。2018年國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布中國骨質疏松癥流行病學調查結果顯示：OP已成為我國中老年人群的重要健康問題，50歲以上人群患病率為19.2%，且女性發(fā)病率明顯高于男性。目前，臨床治療骨質疏松癥的藥物主要包括骨吸收抑制劑（雙磷酸鹽、降鈣素、雌激素等）、骨形成促進劑（甲狀旁腺激素類似物）及其他機制類藥物（活性維生素D及其類似物、維生素K2類等）。

免疫炎性反應是介導骨質疏松癥發(fā)生的重要因素之一[8]，TNF-α是一類重要的單核炎癥因子，可以通過抑制細胞外基質沉積，降解有機骨質，參與調節(jié)骨吸收，通過介導破骨細胞增殖分化影響骨代謝[9]。IL-6是具有多種生物學作用的炎癥因子，在骨的多種生物學活動中發(fā)揮著重要作用[10-12]。實驗研究認為IL-6可參與加強成骨、破骨細胞相互作用從而促進破骨細胞形成。IL-1可增強破骨細胞活性，使骨吸收與骨破壞失衡誘導骨質疏松，與IL-6相互協(xié)同[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1含量明顯低于模型組，說明健步湯可干預炎癥因子對破骨細胞的影響，降低破骨細胞活化。

中醫(yī)學中無“骨質疏松癥”的病名，但依據(jù)其癥狀和發(fā)病特點，應歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇。其主要病機為腎精虧耗[14]?！端貑枴り庩枒蟠笳撈吩疲骸澳晁氖帤庾园胍玻鹁铀ヒ印?，腎臟虛損，沖任失調，天癸漸竭；腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨骼，故腎精充盈則養(yǎng)骨、健骨，腎精虧損則無以濡養(yǎng)筋骨。

健步湯由《傷科補要》中的“健步虎潛丸”化裁而來，健步湯的組方原則為補肝腎、強筋骨、祛痹痛。方中龜甲膠咸甘微寒，滋陰潛陽；鹿得陽氣之精華，鹿角膠可溫補腎陽；兩藥合用取“龜鹿二仙膠”之意，與熟地黃共為君藥，發(fā)揮滋補肝腎之功；人參補中益氣，與鹿角膠同用，可補氣助陽，與龜甲膠同用，可益氣生津；制何首烏、白芍、當歸柔肝養(yǎng)血；杜仲、鎖陽強筋健骨；川附子、狗骨（虎骨替代品）散寒止痛，共為臣藥；佐藥羌活、威靈仙祛風濕，黃柏清熱燥濕，白術健脾化濕，四藥合用共奏祛濕止痛之效；牛膝引血下行，活血化瘀，調和諸藥為使藥。諸藥合用功擅滋補肝腎、益氣活血、祛風除濕，使陰陽調和、筋骨強健。現(xiàn)代藥理學研究[15-18]表明，健步湯中多味單藥有效成分可通過調控相關基因表達，發(fā)揮抑制細胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用，可有效延緩骨質疏松的病理進程。前期研究表明[19]，健步虎潛丸可明顯改善原發(fā)性骨質疏松癥患者臨床癥狀、促進骨代謝，且補益肝腎類中藥[20]安全性高，療效顯著。羅毅等[21]研究表明經(jīng)健步虎潛丸血清處理后的大鼠成骨細胞，可從活躍轉向成熟狀態(tài)，且不同濃度及時間對細胞生長有一定影響，表明健步虎潛丸對促進骨形成有著重大意義。同時本研究發(fā)現(xiàn)，健步湯可增加大鼠股骨骨小梁數(shù)量、厚度，促進鈣鹽沉積，證實健步湯具有強骨作用。

綜上所述，健步湯可有效改善去勢大鼠骨質疏松癥模型的骨代謝程度，提高骨密度，其作用機制可能與降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1表達相關。健步湯能促進成骨細胞增殖分化，降低破骨細胞活性，改善骨小梁結構，從而延緩骨質疏松進程，其療效與西藥雌激素類作用相當，但健步湯中組成方藥較多，其有效成分及作用機制仍需進一步探索。