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        健步湯對去勢大鼠骨質疏松癥模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1表達的影響*

        2021-11-22 12:21:06馮帥華肖文仲王國峰張曉晟胡桔花王哲享
        中醫(yī)藥導報 2021年4期
        關鍵詞:中藥血清手術

        馮帥華,肖文仲,王國峰,張曉晟,胡桔花,王哲享

        (1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410006;2.湖南中醫(yī)藥大學,湖南 長沙 410208)

        骨質疏松癥(osteoporosis,OP)[1]是一類以骨組織微結構破壞為特征,造成骨強度下降,最終導致骨折等其他全身性骨病的疾病。隨著老年人口比重的逐年升高,OP已成為各國常見的嚴重危害人們健康的慢性疾病之一[2],直接或間接影響生活質量。目前西藥在治療骨質疏松癥方面有一定的療效,但同時伴有一定副作用,如長期激素治療可出現(xiàn)凝血功能障礙、高血壓、水腫、子宮內膜癌、乳腺癌等[3-6]。中藥防治OP安全性高、毒副作用小,但目前并沒有公認的中藥制劑。筆者在臨床中運用健步湯治療老年性骨質疏松癥療效滿意,為進一步研究健步湯的作用機制,筆者借助去勢大鼠骨質疏松癥模型,觀察健步湯對去勢大鼠骨質疏松癥模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1的影響,探討其部分作用機制。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物 44只SPF級6個月齡健康雌性(未交配)SD大鼠,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2016-0002,體質量230~250 g,由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫控制于18~28 ℃,12 h間隔照明,定期消毒和通風。本實驗經(jīng)過湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院倫理委員會審核,批號:倫審(201701)25號。

        1.2 實驗藥物 健步湯:龜甲膠、鹿角膠、狗骨、制何首烏、川牛膝、杜仲、鎖陽、當歸、熟地黃、威靈仙各12 g,黃柏、人參、羌活、白芍、白術、附子各9 g,中藥均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供。戊酸雌二醇片(法國DELPHARM Lille S.A.S,藥物批準文號:國藥準字J20080036)。

        1.3 主要儀器與試劑 自動脫水機(湖北泰康醫(yī)療設備有限公司),珊頓包埋機(青島方信醫(yī)巧器械有限公司),冰凍切片機(英國珊頓公司),顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)。Motic6.0圖文分析系統(tǒng)(美國Hologic公司),HOLOGIC4 500A型雙能X線骨密度掃描儀(美國Hologic公司),徠卡病理系統(tǒng)(德國Leica公司)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號:20180614)、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒(批號:20180614)、白細胞介素-1(IL-1)試劑盒(批號:20180614)均購自南京建成生物工程研究所。

        1.4 造模及分組 44只雌性SD大鼠,隨機選取12只作為假手術組,假手術組僅行手術摘取卵巢旁約卵巢大小的脂肪組織,不予切除卵巢和結扎輸卵管,其余32只大鼠全部行雙側卵巢切除。采用國內外公認的雌性大鼠去卵巢3個月可形成絕經(jīng)后骨質疏松病理模型。

        造模步驟:2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,備皮消毒,取腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm雙背側縱行切口,依次分離進入腹腔,尋找卵巢組織,平鑷將卵巢牽出,嚴密結扎輸卵管及其周圍血管、脂肪組織,完整切除雙側卵巢,沖洗傷口,止血徹底,逐層縫合,關閉腹腔,術后連續(xù)3 d注射青霉素20萬U,預防感染。連續(xù)喂養(yǎng)12周后,假手術組與手術組各隨機處死2只行股骨HE染色鏡下觀察,假手術組切片鏡下可見大量清晰成骨細胞,形態(tài)完整,骨小梁致密,形態(tài)規(guī)則,生長旺盛,排列有序;與假手術組比較,手術組大鼠股骨骨小梁數(shù)量異常減少、粗細不均、排列無序且斷裂明顯。(見圖1)

        圖1 兩組大鼠股骨組織的形態(tài)結構(HE,×100)

        大鼠剩余40只股骨全部行骨密度(BMD)檢測,結果顯示手術組大鼠股骨BMD顯著低于假手術組(P<0.05),與HE染色結果一致,證明實驗造模成功。(見表1)

        表1 假手術組與手術組大鼠股骨BMD 比較(,g/cm2)

        表1 假手術組與手術組大鼠股骨BMD 比較(,g/cm2)

        造模成功的30只大鼠,按隨機數(shù)字表分為模型組、中藥組和西藥組,每組10只。

        1.5 實驗給藥 術后常規(guī)喂養(yǎng)12周,于第13周開始給藥,中藥組及西藥組灌胃每日所需給藥劑量根據(jù)人的臨床劑量(X mg/kg)按照人體和大鼠體表面積比換算:

        中藥組大鼠予健步湯灌胃:按其原處方量計算,成人每日劑量174 g即2.48 g/kg生藥,換算成大鼠等效劑量則生藥劑量為2.48 g/kg×6.3=15.66 g/kg;參考前期動物實驗有效劑量,本實驗取健步湯每日劑量為20 g/kg,1次/d。藥物煎制方法:每次將2劑藥物,共計348 g,分2次煎煮,每次煎煮時間約為30 min,合計加水2 000 mL,合并2次煎液,并濃縮至348 mL,生藥濃度為1 g/mL,每周制備1次,將煎好的中藥真空包裝冷藏保存?zhèn)溆?。西藥組大鼠予戊酸雌二醇片灌胃:按照成人每日給藥劑量1 mg口服,換算成大鼠等效劑量為0.014 mg/kg×6.3=0.40 mg/kg,1次/d。假手術組、模型組大鼠予等容量生理鹽水灌胃,3mL/次,1次/d。

        以上藥物連續(xù)給藥12周后,處死所有大鼠,檢測相關指標。

        1.6 觀察指標

        1.6.1 骨密度BMD 灌胃12周后將大鼠進行麻醉,仰臥位置于QDR-4500A雙能X線骨密度診斷儀上,測量分析股骨近端干骺端及第4腰椎、第5腰椎BMD。

        1.6.2 炎癥因子 分別將受試大鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血2 mL,離心10 min(3 000 r/min)分離血清5 min,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用雙抗夾心法測定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1水平。

        1.6.3 骨組織形態(tài)學 將大鼠麻醉處死后取股骨,對股骨標本進行常規(guī)處理后,用生理鹽水沖洗,股骨標本固定于4%的多聚甲醛24 h,然后加入含5.5%EDTA的10%中性福爾馬林溶液進行脫鈣36 h,放置梯度乙醇逐漸脫水、浸蠟、石蠟包埋,正中矢狀面連續(xù)切片,切片厚為5 μm,然后使用蘇木精-伊紅染液進行染色,光鏡下隨機選取兩組骨組織高倍視野拍照,并觀察切面單位視野內的骨小梁、軟骨細胞等,進行組織形態(tài)學觀察。

        1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以()表示。符合方差齊性檢驗時采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 大鼠一般情況 本次實驗過程中4組大鼠狀況良好,行造模手術后1周,由于受麻醉劑及相關器官損傷的影響,進食量稍低,體質量增長無明顯差異。大鼠造模手術切口均在1周內愈合。實驗過程中無大鼠死亡。

        2.2 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較 給藥12周后,模型組大鼠腰椎、股骨BMD水平顯著低于假手術組(P<0.05);中藥組及西藥組大鼠腰椎、股骨BMD顯著高于模型組(P<0.05);中藥組與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(見表2)

        表2 各組大鼠腰椎、股骨BMD 比較(,g/cm2)

        表2 各組大鼠腰椎、股骨BMD 比較(,g/cm2)

        注:與假手術組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

        2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平均明顯高于假手術組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);西藥組與中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平明顯低于模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(見表3)

        表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比較()

        表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比較()

        注:與假手術組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

        2.4 組織形態(tài)學觀察結果 假手術組大鼠股骨切片鏡下可見大量清晰成骨細胞,形態(tài)完整,骨小梁致密,形態(tài)規(guī)則,生長旺盛,排列有序。模型組大鼠股骨切片鏡下可見骨小梁排列疏松,數(shù)量明顯低于假手術組,部分骨小梁出現(xiàn)斷裂及鈣鹽沉積減少等骨質疏松特征性表現(xiàn)。西藥組大鼠股骨切片鏡下可見骨組織結構較模型組完整,骨小梁相對完整,骨小梁較致密,骨小梁間有少量斷裂,形態(tài)相對規(guī)則。中藥組大鼠股骨切片鏡下可見骨組織結構完整,骨小梁較模型組增多明顯,骨小梁間無明顯斷裂,成骨細胞排列整齊,形態(tài)結構規(guī)整,成網(wǎng)狀相連續(xù),鈣鹽沉積較多。(見圖2)

        圖2 各組大鼠股骨骨組織的形態(tài)結構(HE,×100)

        3 討 論

        骨質疏松癥是以骨密度及骨質量下降、微結構改變等為主要表現(xiàn),導致骨脆性增加、骨折及全身性骨病發(fā)生的一類與年齡相關的代謝性疾病。臨床上以原發(fā)性骨質疏松癥較為常見,包括Ⅰ型原發(fā)性骨質疏松癥(絕經(jīng)后骨質疏松癥)和Ⅱ型原發(fā)性骨質疏松癥(老年骨質疏松癥)。增齡和不健康生活方式是骨質疏松癥高發(fā)的主要原因[7]。2018年國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布中國骨質疏松癥流行病學調查結果顯示:OP已成為我國中老年人群的重要健康問題,50歲以上人群患病率為19.2%,且女性發(fā)病率明顯高于男性。目前,臨床治療骨質疏松癥的藥物主要包括骨吸收抑制劑(雙磷酸鹽、降鈣素、雌激素等)、骨形成促進劑(甲狀旁腺激素類似物)及其他機制類藥物(活性維生素D及其類似物、維生素K2類等)。

        免疫炎性反應是介導骨質疏松癥發(fā)生的重要因素之一[8],TNF-α是一類重要的單核炎癥因子,可以通過抑制細胞外基質沉積,降解有機骨質,參與調節(jié)骨吸收,通過介導破骨細胞增殖分化影響骨代謝[9]。IL-6是具有多種生物學作用的炎癥因子,在骨的多種生物學活動中發(fā)揮著重要作用[10-12]。實驗研究認為IL-6可參與加強成骨、破骨細胞相互作用從而促進破骨細胞形成。IL-1可增強破骨細胞活性,使骨吸收與骨破壞失衡誘導骨質疏松,與IL-6相互協(xié)同[13]。本研究發(fā)現(xiàn),中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1含量明顯低于模型組,說明健步湯可干預炎癥因子對破骨細胞的影響,降低破骨細胞活化。

        中醫(yī)學中無“骨質疏松癥”的病名,但依據(jù)其癥狀和發(fā)病特點,應歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇。其主要病機為腎精虧耗[14]?!端貑枴り庩枒蟠笳撈吩疲骸澳晁氖帤庾园胍玻鹁铀ヒ印?,腎臟虛損,沖任失調,天癸漸竭;腎藏精,精生髓,髓養(yǎng)骨骼,故腎精充盈則養(yǎng)骨、健骨,腎精虧損則無以濡養(yǎng)筋骨。

        健步湯由《傷科補要》中的“健步虎潛丸”化裁而來,健步湯的組方原則為補肝腎、強筋骨、祛痹痛。方中龜甲膠咸甘微寒,滋陰潛陽;鹿得陽氣之精華,鹿角膠可溫補腎陽;兩藥合用取“龜鹿二仙膠”之意,與熟地黃共為君藥,發(fā)揮滋補肝腎之功;人參補中益氣,與鹿角膠同用,可補氣助陽,與龜甲膠同用,可益氣生津;制何首烏、白芍、當歸柔肝養(yǎng)血;杜仲、鎖陽強筋健骨;川附子、狗骨(虎骨替代品)散寒止痛,共為臣藥;佐藥羌活、威靈仙祛風濕,黃柏清熱燥濕,白術健脾化濕,四藥合用共奏祛濕止痛之效;牛膝引血下行,活血化瘀,調和諸藥為使藥。諸藥合用功擅滋補肝腎、益氣活血、祛風除濕,使陰陽調和、筋骨強健。現(xiàn)代藥理學研究[15-18]表明,健步湯中多味單藥有效成分可通過調控相關基因表達,發(fā)揮抑制細胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用,可有效延緩骨質疏松的病理進程。前期研究表明[19],健步虎潛丸可明顯改善原發(fā)性骨質疏松癥患者臨床癥狀、促進骨代謝,且補益肝腎類中藥[20]安全性高,療效顯著。羅毅等[21]研究表明經(jīng)健步虎潛丸血清處理后的大鼠成骨細胞,可從活躍轉向成熟狀態(tài),且不同濃度及時間對細胞生長有一定影響,表明健步虎潛丸對促進骨形成有著重大意義。同時本研究發(fā)現(xiàn),健步湯可增加大鼠股骨骨小梁數(shù)量、厚度,促進鈣鹽沉積,證實健步湯具有強骨作用。

        綜上所述,健步湯可有效改善去勢大鼠骨質疏松癥模型的骨代謝程度,提高骨密度,其作用機制可能與降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1表達相關。健步湯能促進成骨細胞增殖分化,降低破骨細胞活性,改善骨小梁結構,從而延緩骨質疏松進程,其療效與西藥雌激素類作用相當,但健步湯中組成方藥較多,其有效成分及作用機制仍需進一步探索。

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