楊春燕，葉向鋒，魏金鋒，顧 磊，戴凱琴

（1.北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，北京 100076；2.廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司，上海 200080）

麒麟丸（國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930034）為國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血的作用，主要治療男子不育及女子不孕癥。制何首烏是麒麟丸的主要成分之一，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)和強(qiáng)筋骨等功效，主要用于治療血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白及腰膝酸軟等[1]。近年來(lái)關(guān)于何首烏及其制劑引起的不良反應(yīng)日益增多，其主要臨床表現(xiàn)為肝損傷，國(guó)內(nèi)有關(guān)何首烏不良反應(yīng)文獻(xiàn)中肝損傷約占93.47%[2-4]。雖然何首烏經(jīng)過(guò)加工炮制后其肝毒性能降低，達(dá)到去毒減毒的目的[5-6]，但是仍有研究發(fā)現(xiàn)制何首烏會(huì)引起不同程度的肝損傷[7]。麒麟丸治療不孕不育已在臨床上廣泛使用，但關(guān)于其以制何首烏為主要成分的肝毒性卻鮮有報(bào)道。因此，本研究擬采用SD大鼠90 d連續(xù)灌胃給予麒麟丸和制何首烏提取物，考察可能出現(xiàn)的肝臟毒性，以期為臨床進(jìn)一步合理、安全地應(yīng)用麒麟丸提供參考和指導(dǎo)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 6～7周齡SPF級(jí)SD大鼠150只，雌雄各半，雌鼠體質(zhì)量154～177 g，雄鼠體質(zhì)量151～173 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，室溫（23.2±0.9）℃，相對(duì)濕度（62.5±4.1）%，最小換氣次數(shù)15次/h，光照明∶黑暗=12 h∶12 h，整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中保持動(dòng)物飲食活動(dòng)自由。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物及相關(guān)處置符合動(dòng)物福利的要求，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前經(jīng)過(guò)了北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)（IACUC）的審查批準(zhǔn)，受理編號(hào)：SN13157-DC。SPF大鼠飼料由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2012-0003。

1.2 藥物 麒麟丸（廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：B20130704，規(guī)格：90 g/瓶）；制何首烏提取物（浸膏）（廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：B20140508）；制何首烏按麒麟丸處方工藝單獨(dú)提取浸膏，每克浸膏含大黃素0.52 mg，含二苯乙烯苷13.2 mg。

1.3 試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT/GPT）試劑盒（批號(hào)：140591）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST/GOT）試劑盒（批號(hào)：140531）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號(hào)：140691）、尿素（UREA）試劑盒（批號(hào)：140631）、尿酸（UA）試劑盒（批號(hào)：130511）、總膽固醇（CHO）試劑盒（批號(hào)：131121）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號(hào)：130711）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號(hào)：140551）、肌酸激酶（CK）試劑盒（批號(hào)：140561）、總蛋白（TP）試劑盒（批號(hào)：130491）、白蛋白（ALB）試劑盒（批號(hào)：140511）、肌酐（CRE）試劑盒（批號(hào)：130461）、葡萄糖（GLU）試劑盒（批號(hào)：130621）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（批號(hào)：AUZ1005）、血清鈣（Ca）試劑盒（批號(hào)：140441）（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；凝血酶原時(shí)間（PT）試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）試劑盒（法國(guó)思達(dá)高公司）；滅菌注射用水（山東齊都藥業(yè)有限公司）。

1.4 主要儀器 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；STA-4型半自動(dòng)四通道血液凝固測(cè)定儀（法國(guó)STAGO公司）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；COULTERAU480型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)BECKMAN公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 將150只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組，雌雄各半，每組30只。

2.2 制何首烏的制備 麒麟丸和制何首烏提取物所使用的藥材制何首烏采用黑豆汁拌勻潤(rùn)透3～4 h，蒸制5～6 h后再保溫燜潤(rùn)6～8 h，晾藥后制得。

2.3 劑量設(shè)計(jì) 麒麟丸的臨床擬用劑量為6 g/次，2～3次/d，每日劑量為12～18 g。按成人一般體質(zhì)量以60 kg計(jì)，每日成人擬用劑量為200～300 mg/kg。實(shí)驗(yàn)中麒麟丸低、中、高劑量組大鼠給藥量分別相當(dāng)于臨床成人每日最大劑量的6.7、13.3、26.7倍，即2 000、4 000、8 000 mg/kg。制何首烏提取物組按照麒麟丸高劑量組（8 000 mg/kg）所含制何首烏計(jì)算給藥劑量，實(shí)驗(yàn)中制何首烏給藥劑量354 mg/kg（0.18 mg/kg大黃素、4.67 mg/kg二苯乙烯苷）相當(dāng)于臨床成人每日服用麒麟丸最大劑量中所含制何首烏的26.7倍，折合成制何首烏生藥量為8 g/kg。

2.4 給藥和取材 麒麟丸低、中、高劑量組和制何首烏提取物組灌胃給予相應(yīng)藥物，大鼠給藥體積均為2 mL/100 g，對(duì)照組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥90 d。給藥結(jié)束時(shí)每組分別處死20只大鼠（雌雄各半），在給藥結(jié)束后設(shè)恢復(fù)期30 d，30 d后處死各組剩余大鼠。全部大鼠腹腔注射2.0%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血后處死，進(jìn)行解剖。肉眼檢查組織器官有無(wú)異常，對(duì)肝臟進(jìn)行稱(chēng)重，并計(jì)算肝臟指數(shù)=（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。

2.5 一般情況觀察 觀察并記錄各組大鼠的一般情況，包括外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸情況、進(jìn)食狀況、體質(zhì)量及體溫變化。

2.6 血液生化相關(guān)檢查 各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后，進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢查，IFCC連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）；雙縮脲終點(diǎn)法檢測(cè)總蛋白（TP）；溴甲酚綠終點(diǎn)法檢測(cè)白蛋白（ALB）；計(jì)算法檢測(cè)球蛋白（GLB）、白球比（A/G）；礬酸氧化法檢測(cè)總膽紅素（TBIL）；對(duì)硝基苯膦酸二鈉連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）；乳酸基質(zhì)連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）；N-乙酰半胱氨酸連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)肌酸激酶（CK）；葡萄糖氧化酶終點(diǎn)法檢測(cè)葡萄糖（GLU）；谷氨酸脫氫酶兩點(diǎn)法檢測(cè)尿素（UREA）；尿酸酶終點(diǎn)法檢測(cè)尿酸（UA）；苦味酸兩點(diǎn)法檢測(cè)肌酐（CREA）；膽固醇氧化酶終點(diǎn)法檢測(cè)總膽固醇（CHOL）；甘油磷酸氧化酶終點(diǎn)法檢測(cè)甘油三酯（TG）。另取血樣，磁珠法檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（PT）和活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）。

2.7 組織病理學(xué)檢查 用10%中性福爾馬林固定，固定后逐級(jí)酒精脫水，石蠟包埋、切片。經(jīng)蘇木素-伊紅染色，光鏡下進(jìn)行檢查。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠一般情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組大鼠的行為活動(dòng)、外觀體征、糞便及尿液等均未見(jiàn)異常。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量和大鼠攝食量比較 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組雌、雄鼠的體質(zhì)量均不斷增長(zhǎng)，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠的體質(zhì)量及攝食量與對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異。表明長(zhǎng)期灌胃麒麟丸不會(huì)影響大鼠的體質(zhì)量和攝食量。

3.3 各組大鼠肝臟指數(shù)比較 給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組大鼠的肝臟指數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)比較（，%）

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)比較（，%）

3.4 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較 給藥結(jié)束時(shí)，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌鼠的血清生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。麒麟丸低劑量雄鼠的A/G明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）；麒麟丸中、高劑量組TBIL明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雄鼠其余血清生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠的血清生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表2～3）

表2 各組雌鼠生化指標(biāo)比較（）

表2 各組雌鼠生化指標(biāo)比較（）

表3 各組雄鼠生化指標(biāo)比較（）

表3 各組雄鼠生化指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

給藥結(jié)束時(shí)，麒麟丸高劑量組雄鼠的APTT明顯短于對(duì)照組（P＜0.05），制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠其余凝血指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠的各項(xiàng)凝血指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表4）

表4 各組大鼠鼠凝血指標(biāo)比較（，s）

表4 各組大鼠鼠凝血指標(biāo)比較（，s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

3.5 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變 給藥結(jié)束時(shí)，與對(duì)照組比較，麒麟丸高劑量組和制何首烏提取物組大鼠的肝臟未見(jiàn)明顯與給藥相關(guān)的毒性病理改變；恢復(fù)期結(jié)束，麒麟丸高劑量組和制何首烏提取物組大鼠的肝臟未發(fā)現(xiàn)延遲或蓄積毒性病理改變。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠肝臟病理切片圖（HE，×20）

4 討 論

麒麟丸是運(yùn)用中醫(yī)學(xué)“腎主生殖”的理論，在五子衍宗丸基礎(chǔ)上研制的治療不孕不育的中成藥，目前在臨床上用于治療少弱精子癥等男性不育疾病[8]。已有研究顯示麒麟丸在增加患者的精子質(zhì)量，優(yōu)化睪丸內(nèi)環(huán)境等方面具有較好的臨床療效和安全性[9-10]。涂燦等[11]對(duì)何首烏及其制劑的臨床不合理用藥方式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其不合理用藥主要涉及三超用藥、采用非傳統(tǒng)用藥方式和不恰當(dāng)聯(lián)合用藥等方面。何首烏及其制劑肝損傷的臨床表現(xiàn)主要是黃疸、乏力、尿黃和皮膚黃等，臨床指標(biāo)主要表現(xiàn)為ALT、AST水平升高[4]。有研究報(bào)道何首烏及制何首烏能抑制大鼠原代肝細(xì)胞的增殖，減少膽紅素的攝取及膽汁排泄，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷[12]。謝麗華等[13]發(fā)現(xiàn)何首烏醇提物能抑制肝藥酶CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1等亞型活性抑制，減慢機(jī)體代謝速度，增高血藥濃度或引起蓄積，導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，引起肝損傷。因此，本研究為探索麒麟丸和其所含制何首烏的毒性，故增加制何首烏提取物組。

本研究中，麒麟丸低、中、高劑量組及制何首烏提取物組總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、凝血酶原時(shí)間（PT）等反映了肝細(xì)胞蛋白合成代謝功能的正常；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）等也說(shuō)明肝細(xì)胞未受到損傷；總膽紅素（TBIL）等指標(biāo)也反映肝臟排泄、分泌及解毒功能正常。同時(shí)病理組織也顯示肝臟均未見(jiàn)明顯損傷。

麒麟丸（2 000～8 000 mg/kg）及制何首烏提取物（354 mg/kg）長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)大鼠無(wú)明顯肝臟毒性，可能與制何首烏的蒸制、燜潤(rùn)時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。何首烏經(jīng)炮制后其毒性減少，但是炮制方法、時(shí)間對(duì)何首烏成分及肝毒性均有影響[14]。制何首烏為中藥材何首烏的炮制加工品，有黑豆汁蒸制法和清蒸法，同時(shí)采用常壓或高壓蒸制[15]。王燕青等[16]對(duì)何首烏生品及不同炮制方法制備的炮制品進(jìn)行急性毒性研究，發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃何首烏不同炮制品水提物后主要急性毒性癥狀有腹瀉、怠動(dòng)、毛色不華，其對(duì)小鼠急性毒性強(qiáng)度依次為生品組＞黑豆煮組＞黑豆汁蒸6 h組＞隔水燉組＞清蒸組＞黑豆汁蒸18 h組。何首烏引起肝毒性的主要化合物可能為順式二苯乙烯苷和大黃素-8-Oβ-D-葡萄糖苷[17-18]；而何首烏經(jīng)黑豆蒸制后，對(duì)肝細(xì)胞的毒性降低，且潛在可能毒性成分順式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量也降低[19]。SD大鼠灌胃大黃素（12 mg/kg）60 d反復(fù)給藥未見(jiàn)明確的肝毒性，肝臟未見(jiàn)腫大，肝臟指數(shù)未升高[20]，與本實(shí)驗(yàn)制何首烏提取物反復(fù)灌胃給藥結(jié)果一致。

本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在給藥結(jié)束時(shí)麒麟丸低劑量組雄鼠A/G較對(duì)照組低16.7%；麒麟丸中、高劑量組雄鼠TBIL水平較對(duì)照組均升高22.2%；這兩項(xiàng)指標(biāo)的變化均無(wú)劑量效應(yīng)關(guān)系，且制何首烏提取物組雄鼠這兩項(xiàng)指標(biāo)基本與對(duì)照組一致，判斷這兩項(xiàng)指標(biāo)變化無(wú)毒理學(xué)意義。本次研究中麒麟丸低、中、高劑量組及制何首烏提取物組的給藥量分別相當(dāng)于臨床成人每日最大劑量的6.7、13.3、26.7倍，SD大鼠灌胃麒麟丸（2 000～8 000 mg/kg）以及制何首烏提取物（354 mg/kg）90 d反復(fù)給藥對(duì)大鼠無(wú)明顯肝臟毒性。麒麟丸臨床劑量安全范圍較大，為麒麟丸的臨床應(yīng)用提供了安全性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。