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        雞血蓮黃酮通過調(diào)節(jié)AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路改善小鼠非酒精性脂肪肝的實驗研究

        2021-11-22 12:20:48阮金蘭
        中醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年4期
        關(guān)鍵詞:黃酮小鼠質(zhì)量

        楊 嫻,阮金蘭

        (1.石家莊四藥有限公司藥物研究院,河北 石家莊 050000;2.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430223)

        非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種在無酒精濫用、病毒性肝炎、藥物因素和自身免疫性肝炎等原因的情況下,肝臟的脂肪變性疾病[1]。據(jù)報道,預(yù)計在未來10年之內(nèi),NAFLD患者的數(shù)量將急劇增加,并將于2030年成為肝移植最常見的指征[2]。NAFLD包括廣泛的肝臟病理改變,從單純性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纖維化和肝硬化,甚至部分患者可發(fā)展為肝癌[3]。臨床和非臨床研究表明,NAFLD患者和動物模型的活性氧(reactive oxygen species,ROS)和炎性細胞因子水平均升高[4-5]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在NAFLD從單純性脂肪變性到晚期脂肪變性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ROS能夠誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)進而刺激Kupffer細胞合成和釋放TGF-β、IL-6和TNF-α等炎癥因子,這些炎癥因子刺激肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞,誘發(fā)肝臟纖維化和肝細胞壞死的發(fā)生,從而加重NAFLD[6-7]。

        雞血蓮是金星蕨科,新月蕨屬,披針新月蕨[Abacopteris penangiana (Hook.) Ching]的根莖,它作為我國土家族與苗族的傳統(tǒng)藥物,歷史悠久。雞血蓮含有豐富的黃酮成分,尤其是黃烷-4-醇苷類化合物,其中7-羥基-4-甲氧基-6,8-二甲基花青素是雞血蓮黃酮的主要成分。前期藥理學(xué)研究表明雞血蓮黃酮具有明確的抗炎和抗氧化活性[8-11]。有研究表明,具有抗氧化和抗炎作用的中草藥有助于NAFLD疾病進展的控制[12-13]。本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型,觀察雞血蓮黃酮對NAFLD小鼠的作用,并探討其作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 40只6~8周齡SPF級雄性昆明小鼠,體質(zhì)量18~22 g,購自華中科技大學(xué)實驗動物中心,動物許可證號:SCXK(鄂)2010-0009。經(jīng)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn),在溫度(25±5)℃,濕度(65±5)%,12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),允許其自由飲水與飲食,同時密切觀察實驗動物的存活狀況。

        1.2 藥物與試劑 雞血蓮采收自湖北省恩施自治州,九江市森林植物標(biāo)本館譚策名研究員鑒定其為金星蕨科新月蕨屬植物披針新月蕨[Abacopteris penangiana (Hook.) Ching]的根莖。取雞血蓮2 kg經(jīng)粉碎后,用80%(V/V)乙醇回流提取1 h。提取液經(jīng)減壓,濃縮,干燥,得到雞血蓮總提取物。將總提取物以3 mg/mL的濃度加到HPD500大孔樹脂柱中,先用上樣量5倍的水進行沖洗,然后用5倍量的70%(V/V)乙醇進行沖洗,收集洗脫液,濃縮、干燥、得黃酮提取物187 g。以Triphyllin A作為對照品,采用紫外分光光度法,在波長276 nm處,測定雞血蓮黃酮中黃酮的含量。

        Triphyllin A(華中科技學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,湖北省天然藥物化學(xué)與資源評價重點實驗室提供,純度>98%);HPD 500大孔樹脂(Bon Adsorher Technology Company);膽固醇(TC)試劑盒(批號:A111-2-1)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號:A110-2-1)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(批號:C010-2-1)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號:C009-3-1)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號:A003-1-2)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號:A007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號:A001-1-2)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號:A005-1-2)(南京建成生物工程有限公司);腫瘤壞死因子α(TNF-a)ELISA試劑盒(批號:ECM102a.96)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(批號:ECMC004(H).96)、白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(批號:ECMC0013.96)(欣博盛生物科技有限公司);NF-κB抗體(批號:8242)、AMPK抗體(批號:2532)、Sirt1抗體(批號:8469)(Cell Signaling Technology)。

        高脂飲食配方:正常飼料47%,豬油20%,蛋黃20%,蔗糖10%,膽固醇2%,膽酸鹽1%[10]。

        1.3 主要儀器 XD-101型倒置顯微鏡(南京江南光電集團股份有限公司);酶標(biāo)儀(三元科技有限公司);UV1910型紫外可見分光光度計(上海凌光技術(shù)有限公司);RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪高科儀器廠);Gel Doc XR+型凝膠電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio Rad公司)。

        1.4 造模與分組 40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分為正常組、模型組、雞血蓮黃酮高劑量組、雞血蓮黃酮低劑量組,每組10只。正常組飼喂常規(guī)飼料,其余各組采用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型[10],飼喂高脂飼料連續(xù)4周后,各組隨機選取2只動物采用脊椎脫臼法處死,取出肝臟,觀察肝臟病理學(xué)變化。高脂飲食期間,觀察高脂喂養(yǎng)小鼠的體征變化,其中觀察到毛色發(fā)黃伴有油膩感,體質(zhì)量增加,連續(xù)血脂、肝功能檢測異常,結(jié)合肝臟HE染色出現(xiàn)明顯大小不一的脂肪空泡,判斷模型復(fù)制成功。

        1.5 實驗給藥 造模成功后,劑量設(shè)計參考文獻[8],雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠分別灌胃給予200、100 mg/kg雞血蓮黃酮提取物;正常組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水,連續(xù)4周。給藥期間,正常組繼續(xù)飼喂常規(guī)飼料,其余各組飼喂高脂飼料。

        1.6 觀察指標(biāo)

        1.6.1 體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝指數(shù)的測定 末次給藥后,各組小鼠禁食12 h,稱定各組小鼠體質(zhì)量,摘眼球取血,斷頸處死,分離腹部脂肪,稱質(zhì)量;剝離完整肝臟,用生理鹽水將肝臟沖洗干凈,濾紙吸干表面水分,精密稱定質(zhì)量,計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

        1.6.2 小鼠血清AST、ALT及血脂水平的檢測 小鼠摘眼球取血,血液放置于1.5 mL離心管中,冰上靜置30 min后,3 500 g離心15 min,吸取上清,參照試劑盒說明測定TC、TG、AST和ALT的含量。

        1.6.3 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測 取相同部位的肝組織0.5 g,將肝臟剪碎后,按照1∶9(m/V)的比例放入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中,制備10%肝組織勻漿。勻漿液在4 ℃3 500 g下離心15 min,吸取上清,參照試劑盒說明測定MDA、SOD、CAT和GSH-Px的含量。

        1.6.4 肝臟組織學(xué)觀察及免疫組化染色 取相同部位的肝組織,4%多聚甲醛固定24 h,先后經(jīng)酒精脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋等步驟,隨后以4 μm厚度切片,切片以常規(guī)方法進行蘇木精-伊紅(HE)染色,封片,200倍光學(xué)顯微鏡下觀測肝臟組織形態(tài)改變情況。

        此外,用脫蠟切片進行免疫組化分析。將上述石蠟包埋的組織切成小薄片,在37 ℃恒溫烘箱中烘干,脫蠟,3% H2O2室溫浸泡,5%山羊血清封閉切片,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,加NF-κB(1∶200)4 ℃冰箱中保存孵育過夜,然后加入HRP標(biāo)記的第二抗體并于37 ℃恒溫箱中溫育30 min。PBS沖洗后加入顯色劑,將顯色后的薄片用蒸餾水沖洗,蘇木精染色切片,酒精脫水,置于200倍顯微鏡下觀察。

        1.6.5 肝臟炎癥因子檢測 肝臟上清液采用“1.6.3”方法制備,ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,具體步驟參照試劑盒說明書。

        1.6.6 小鼠肝臟組織中Sirt1和AMPK蛋白的檢測 Western blotting法檢測肝臟組織中Sirt1和AMPK蛋白的表達。肝組織經(jīng)研磨后用BCA試劑盒測定蛋白含量,50 μg蛋白用10%SDS-PAGE處理后,恒壓100 V,1.5 h轉(zhuǎn)膜。PVDF膜與一抗Sirt1(1∶500),AMPK(1∶500);β-actin(1∶500)4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后,PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h。按電化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書步驟,配備顯影液,顯影。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 雞血蓮黃酮中黃酮的含量 線性回歸方程:A=3.963 7C+0.005 7,R=0.999 8,C=0.012 5~0.400 0 mg/mL。說明濃度在0.012 5~0.400 0 mg/mL的范圍內(nèi),化合物Triphyllin A濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。最終測得,雞血蓮黃酮中黃酮的含量為69.4%。

        2.2 各組小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較 模型組小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均高于正常組(P<0.05);雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均低于模型組(P<0.05);雞血蓮黃酮低劑量組小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均高于雞血蓮黃酮高劑量組(P<0.05)。(見表1)

        表1 各組小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較()

        表1 各組小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較()

        注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雞血蓮黃酮高劑量組比較,cP<0.05

        2.3 各組小鼠血清AST、ALT、TC、TG水平比較 模型組小鼠血清TC、TG、ALT和AST高于正常組(P<0.05),說明高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝功能異常及體內(nèi)脂代謝紊亂,提示造模成功;雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠血清TC、TG、ALT和AST低于模型組(P<0.05);雞血蓮黃酮低劑量組小鼠血清TC、TG、ALT和AST均高于雞血蓮黃酮高劑量組(P<0.05)。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝功能異常及脂代謝紊亂。(見表2)

        表2 各組小鼠血清TC,TG,AST 和ALT 比較()

        表2 各組小鼠血清TC,TG,AST 和ALT 比較()

        注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雞血蓮黃酮高劑量組比較,cP<0.05

        2.4 各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 模型組小鼠肝臟中MDA含量高于正常組(P<0.05),SOD、CAT及GSH-px含量低于正常組(P<0.05),提示NAFLD小鼠肝臟內(nèi)存在氧化應(yīng)激;雞血蓮黃酮高劑量組中MDA含量低于模型組(P<0.05),SOD及GSH-px含量高于模型組(P<0.05);雞血蓮黃酮低劑量組中MDA含量低于模型組(P<0.05),SOD、GSH-px含量高于模型組(P<0.05),而CAT含量與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);雞血蓮黃酮低劑量組中MDA含量高于雞血蓮黃酮高劑量組(P<0.05),SOD、CAT及GSH-px含量均低于雞血蓮黃酮高劑量組(P<0.05)。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠改善NAFLD小鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)。(見表3)

        表3 各組小鼠肝組織中MDA、SOD、CAT 及GSH-px 含量比較()

        表3 各組小鼠肝組織中MDA、SOD、CAT 及GSH-px 含量比較()

        注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雞血蓮黃酮高劑量組比較,cP<0.05

        2.5 各組小鼠肝臟組織及病理學(xué)變化 正常組小鼠肝臟紅潤,肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝細胞結(jié)構(gòu)清晰完整,細胞內(nèi)無明顯脂滴沉積;模型組小鼠肝臟外觀明顯發(fā)黃,肝臟組織內(nèi)充滿大量大小不一的脂肪空泡,肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂、膨脹,大量炎細胞浸潤,提示造模成功;雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠肝組織與正常組比較,仍可見輕至中度肝細胞脂肪變性,但與模型組比較,脂肪變性程度減輕,胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少,同時細胞體積縮小,炎性細胞的浸潤程度降低。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂肪變性和炎癥病變。(見圖1~2)

        圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)圖

        圖2 各組小鼠肝組織病理切片圖(HE,×200)

        2.6 各組小鼠炎癥指標(biāo)比較 模型組小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6含量高于正常組(P<0.05),提示NAFLD小鼠肝臟存在炎癥反應(yīng);雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6含量低于模型組(P<0.05);雞血蓮黃酮低劑量組小鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6含量均高于雞血蓮黃酮高劑量組(P<0.05)。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠降低NAFLD小鼠肝臟炎癥因子水平。(見表4)

        表4 各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量比較(,μg/mL)

        表4 各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量比較(,μg/mL)

        注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雞血蓮黃酮高劑量組比較,cP<0.05

        2.7 各組小鼠肝臟NF-κB表達比較 與正常組比較,模型組呈深棕色,提示NF-κB的表達量增加;雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠肝組織與模型組比較,棕色變淺,提示NF-κB的表達量下降。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NF-κB表達量增加。(見圖3)

        圖3 各組小鼠肝臟NF-κB 表達情況

        2.8 各組小鼠Sirf1和AMPK蛋白表達比較 模型組小鼠肝臟中Sirt1和AMPK表達量低于正常組(P<0.05);雞血蓮黃酮高劑量組小鼠肝臟中Sirt1和AMPK表達量高于模型組(P<0.05)。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠部分逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟中Sirt1和AMPK表達障礙。(見圖4、表5)

        圖4 各組小鼠Sirf1 和AMPK 蛋白表達的比較

        表5 各組小鼠Sirf1 和AMPK 蛋白表達比較()

        表5 各組小鼠Sirf1 和AMPK 蛋白表達比較()

        注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

        3 討 論

        NAFLD是一種臨床常見的慢性肝病,它的發(fā)生往往與肥胖、高血壓、2型糖尿病及血脂異常等因素有關(guān)。血漿中的脂質(zhì)含量與NAFLD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。NAFLD患者體內(nèi)脂代謝紊亂,一般表現(xiàn)為血漿中的TG、TC、AST、ALT水平較高[14]。高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)高脂血癥及肝臟脂代謝紊亂,引起肝細胞脂肪變性,肝臟結(jié)構(gòu)與功能受損。在本研究中,與正常組比較,模型組小鼠TC、TG、AST、ALT水平增加,說明高脂飼料可成功誘導(dǎo)小鼠脂代謝紊亂。肝臟的病理切片觀察發(fā)現(xiàn),模型組小鼠肝臟組織中出現(xiàn)彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變和炎性細胞,說明NAFLD造模成功,且該模型屬于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

        氧化應(yīng)激對NAFLD的發(fā)展具有促進作用。高脂、高熱量的膳食不僅能夠引起機體脂代謝異常,還能激活細胞內(nèi)還原型酰胺嘌呤二核苷酸磷酸氧化途徑,生成過量ROS,肝臟抗氧化酶活性下降,MDA含量增加,導(dǎo)致胰導(dǎo)素抵抗(IR)、炎癥和纖維化,從而導(dǎo)致NAFLD進一步惡化[15]。本研究中,高脂飲食誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟組織中MDA的含量增加,SOD、GSH-px、CAT的含量降低,表明NAFLD小鼠肝臟發(fā)生了氧化應(yīng)激事件。雞血蓮黃酮能夠增加抗氧化酶的含量,同時降低MDA的含量,進而起到減緩NAFLD的作用。

        過度炎癥反應(yīng)是NAFLD的典型病理改變之一。研究表明,炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6參與了NAFLD繼發(fā)肝損傷[16-17]。在本研究中,HE染色結(jié)果顯示,高脂飲食誘導(dǎo)了小鼠肝臟大量的炎細胞浸潤,肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加,肝臟組織存在炎癥反應(yīng)。雞血蓮黃酮給藥后可有效抑制炎性細胞浸潤,減少TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。提示雞血蓮黃酮能夠抑制炎癥反應(yīng),從而起到抑制NAFLD的作用。

        AMPK是導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生和調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的重要因子。最近的研究報道,藥物可通過AMPK通路增強抗氧化酶活性以減輕氧化應(yīng)激[3]。AMPK通路的激活可增加Sirt1的活性。研究資料證實,Sirt1的激活能夠增加肝內(nèi)線粒體的生成,并促進肝內(nèi)超氧化物歧化酶的表達,從而提高NASH抗氧化應(yīng)激能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠肝臟組織中AMPK、Sirt1的表達下降,而雞血蓮黃酮給藥后能夠增加AMPK、Sirt1的表達。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB存在于多種細胞中,包括脂肪細胞和巨噬細胞,它是一種關(guān)鍵的氧化還原敏感的促炎性轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)多種基因的表達,肝損傷能夠?qū)е翹F-κB的上調(diào)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠肝臟組織中,NF-κB的表達量升高,而雞血蓮黃酮給藥后,NF-κB的表達下降。以上結(jié)果提示雞血蓮黃酮能夠通過調(diào)節(jié)AMPK/Sirt1/NF-κB通路,調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的脂代謝紊亂,減緩由此引發(fā)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

        本研究從動物水平證實雞血蓮黃酮具有緩解NAFLD的潛力,為雞血蓮用于NAFLD治療藥物的開發(fā),提供了實驗依據(jù)。

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