楊 嫻，阮金蘭

（1.石家莊四藥有限公司藥物研究院，河北 石家莊 050000；2.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223）

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種在無酒精濫用、病毒性肝炎、藥物因素和自身免疫性肝炎等原因的情況下，肝臟的脂肪變性疾病[1]。據(jù)報道，預(yù)計在未來10年之內(nèi)，NAFLD患者的數(shù)量將急劇增加，并將于2030年成為肝移植最常見的指征[2]。NAFLD包括廣泛的肝臟病理改變，從單純性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化和肝硬化，甚至部分患者可發(fā)展為肝癌[3]。臨床和非臨床研究表明，NAFLD患者和動物模型的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎性細胞因子水平均升高[4-5]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在NAFLD從單純性脂肪變性到晚期脂肪變性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ROS能夠誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)進而刺激Kupffer細胞合成和釋放TGF-β、IL-6和TNF-α等炎癥因子，這些炎癥因子刺激肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞，誘發(fā)肝臟纖維化和肝細胞壞死的發(fā)生，從而加重NAFLD[6-7]。

雞血蓮是金星蕨科，新月蕨屬，披針新月蕨[Abacopteris penangiana (Hook.) Ching]的根莖，它作為我國土家族與苗族的傳統(tǒng)藥物，歷史悠久。雞血蓮含有豐富的黃酮成分，尤其是黃烷-4-醇苷類化合物，其中7-羥基-4-甲氧基-6,8-二甲基花青素是雞血蓮黃酮的主要成分。前期藥理學(xué)研究表明雞血蓮黃酮具有明確的抗炎和抗氧化活性[8-11]。有研究表明，具有抗氧化和抗炎作用的中草藥有助于NAFLD疾病進展的控制[12-13]。本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型，觀察雞血蓮黃酮對NAFLD小鼠的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只6～8周齡SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自華中科技大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0009。經(jīng)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)，在溫度（25±5）℃，濕度（65±5）%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，允許其自由飲水與飲食，同時密切觀察實驗動物的存活狀況。

1.2 藥物與試劑 雞血蓮采收自湖北省恩施自治州，九江市森林植物標(biāo)本館譚策名研究員鑒定其為金星蕨科新月蕨屬植物披針新月蕨[Abacopteris penangiana (Hook.) Ching]的根莖。取雞血蓮2 kg經(jīng)粉碎后，用80%（V/V）乙醇回流提取1 h。提取液經(jīng)減壓，濃縮，干燥，得到雞血蓮總提取物。將總提取物以3 mg/mL的濃度加到HPD500大孔樹脂柱中，先用上樣量5倍的水進行沖洗，然后用5倍量的70%（V/V）乙醇進行沖洗，收集洗脫液，濃縮、干燥、得黃酮提取物187 g。以Triphyllin A作為對照品，采用紫外分光光度法，在波長276 nm處，測定雞血蓮黃酮中黃酮的含量。

Triphyllin A（華中科技學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖北省天然藥物化學(xué)與資源評價重點實驗室提供，純度＞98%）；HPD 500大孔樹脂（Bon Adsorher Technology Company）；膽固醇（TC）試劑盒（批號：A111-2-1）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號：A110-2-1）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號：C010-2-1）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（批號：C009-3-1）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：A003-1-2）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號：A007-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：A001-1-2）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號：A005-1-2）（南京建成生物工程有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-a）ELISA試劑盒（批號：ECM102a.96）、白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（批號：ECMC004(H).96）、白介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（批號：ECMC0013.96）（欣博盛生物科技有限公司）；NF-κB抗體（批號：8242）、AMPK抗體（批號：2532）、Sirt1抗體（批號：8469）（Cell Signaling Technology）。

高脂飲食配方：正常飼料47%，豬油20%，蛋黃20%，蔗糖10%，膽固醇2%，膽酸鹽1%[10]。

1.3 主要儀器 XD-101型倒置顯微鏡（南京江南光電集團股份有限公司）；酶標(biāo)儀（三元科技有限公司）；UV1910型紫外可見分光光度計（上海凌光技術(shù)有限公司）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪高科儀器廠）；Gel Doc XR+型凝膠電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)（Bio Rad公司）。

1.4 造模與分組 40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、雞血蓮黃酮高劑量組、雞血蓮黃酮低劑量組，每組10只。正常組飼喂常規(guī)飼料，其余各組采用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型[10]，飼喂高脂飼料連續(xù)4周后，各組隨機選取2只動物采用脊椎脫臼法處死，取出肝臟，觀察肝臟病理學(xué)變化。高脂飲食期間，觀察高脂喂養(yǎng)小鼠的體征變化，其中觀察到毛色發(fā)黃伴有油膩感，體質(zhì)量增加，連續(xù)血脂、肝功能檢測異常，結(jié)合肝臟HE染色出現(xiàn)明顯大小不一的脂肪空泡，判斷模型復(fù)制成功。

1.5 實驗給藥 造模成功后，劑量設(shè)計參考文獻[8]，雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠分別灌胃給予200、100 mg/kg雞血蓮黃酮提取物；正常組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水，連續(xù)4周。給藥期間，正常組繼續(xù)飼喂常規(guī)飼料，其余各組飼喂高脂飼料。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝指數(shù)的測定 末次給藥后，各組小鼠禁食12 h，稱定各組小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，斷頸處死，分離腹部脂肪，稱質(zhì)量；剝離完整肝臟，用生理鹽水將肝臟沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，精密稱定質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.6.2 小鼠血清AST、ALT及血脂水平的檢測 小鼠摘眼球取血，血液放置于1.5 mL離心管中，冰上靜置30 min后，3 500 g離心15 min，吸取上清，參照試劑盒說明測定TC、TG、AST和ALT的含量。

1.6.3 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測 取相同部位的肝組織0.5 g，將肝臟剪碎后，按照1∶9（m/V）的比例放入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中，制備10%肝組織勻漿。勻漿液在4 ℃3 500 g下離心15 min，吸取上清，參照試劑盒說明測定MDA、SOD、CAT和GSH-Px的含量。

1.6.4 肝臟組織學(xué)觀察及免疫組化染色 取相同部位的肝組織，4%多聚甲醛固定24 h，先后經(jīng)酒精脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋等步驟，隨后以4 μm厚度切片，切片以常規(guī)方法進行蘇木精-伊紅（HE）染色，封片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀測肝臟組織形態(tài)改變情況。

此外，用脫蠟切片進行免疫組化分析。將上述石蠟包埋的組織切成小薄片，在37 ℃恒溫烘箱中烘干，脫蠟，3% H2O2室溫浸泡，5%山羊血清封閉切片，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加NF-κB（1∶200）4 ℃冰箱中保存孵育過夜，然后加入HRP標(biāo)記的第二抗體并于37 ℃恒溫箱中溫育30 min。PBS沖洗后加入顯色劑，將顯色后的薄片用蒸餾水沖洗，蘇木精染色切片，酒精脫水，置于200倍顯微鏡下觀察。

1.6.5 肝臟炎癥因子檢測 肝臟上清液采用“1.6.3”方法制備，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.6.6 小鼠肝臟組織中Sirt1和AMPK蛋白的檢測 Western blotting法檢測肝臟組織中Sirt1和AMPK蛋白的表達。肝組織經(jīng)研磨后用BCA試劑盒測定蛋白含量，50 μg蛋白用10%SDS-PAGE處理后，恒壓100 V，1.5 h轉(zhuǎn)膜。PVDF膜與一抗Sirt1（1∶500），AMPK（1∶500）；β-actin（1∶500）4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h。按電化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書步驟，配備顯影液，顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雞血蓮黃酮中黃酮的含量 線性回歸方程：A=3.963 7C+0.005 7，R=0.999 8，C=0.012 5～0.400 0 mg/mL。說明濃度在0.012 5～0.400 0 mg/mL的范圍內(nèi)，化合物Triphyllin A濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。最終測得，雞血蓮黃酮中黃酮的含量為69.4%。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較 模型組小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均高于正常組（P<0.05）；雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均低于模型組（P<0.05）；雞血蓮黃酮低劑量組小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)均高于雞血蓮黃酮高劑量組（P<0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較（）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雞血蓮黃酮高劑量組比較，cP<0.05

2.3 各組小鼠血清AST、ALT、TC、TG水平比較 模型組小鼠血清TC、TG、ALT和AST高于正常組（P<0.05），說明高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝功能異常及體內(nèi)脂代謝紊亂，提示造模成功；雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠血清TC、TG、ALT和AST低于模型組（P<0.05）；雞血蓮黃酮低劑量組小鼠血清TC、TG、ALT和AST均高于雞血蓮黃酮高劑量組（P<0.05）。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝功能異常及脂代謝紊亂。（見表2）

表2 各組小鼠血清TC，TG，AST 和ALT 比較（）

表2 各組小鼠血清TC，TG，AST 和ALT 比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雞血蓮黃酮高劑量組比較，cP<0.05

2.4 各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 模型組小鼠肝臟中MDA含量高于正常組（P<0.05），SOD、CAT及GSH-px含量低于正常組（P<0.05），提示NAFLD小鼠肝臟內(nèi)存在氧化應(yīng)激；雞血蓮黃酮高劑量組中MDA含量低于模型組（P<0.05），SOD及GSH-px含量高于模型組（P<0.05）；雞血蓮黃酮低劑量組中MDA含量低于模型組（P<0.05），SOD、GSH-px含量高于模型組（P<0.05），而CAT含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；雞血蓮黃酮低劑量組中MDA含量高于雞血蓮黃酮高劑量組（P<0.05），SOD、CAT及GSH-px含量均低于雞血蓮黃酮高劑量組（P<0.05）。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠改善NAFLD小鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)。（見表3）

表3 各組小鼠肝組織中MDA、SOD、CAT 及GSH-px 含量比較（）

表3 各組小鼠肝組織中MDA、SOD、CAT 及GSH-px 含量比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雞血蓮黃酮高劑量組比較，cP<0.05

2.5 各組小鼠肝臟組織及病理學(xué)變化 正常組小鼠肝臟紅潤，肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞內(nèi)無明顯脂滴沉積；模型組小鼠肝臟外觀明顯發(fā)黃，肝臟組織內(nèi)充滿大量大小不一的脂肪空泡，肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂、膨脹，大量炎細胞浸潤，提示造模成功；雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠肝組織與正常組比較，仍可見輕至中度肝細胞脂肪變性，但與模型組比較，脂肪變性程度減輕，胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少，同時細胞體積縮小，炎性細胞的浸潤程度降低。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂肪變性和炎癥病變。（見圖1～2）

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)圖

圖2 各組小鼠肝組織病理切片圖（HE，×200）

2.6 各組小鼠炎癥指標(biāo)比較 模型組小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6含量高于正常組（P<0.05），提示NAFLD小鼠肝臟存在炎癥反應(yīng)；雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6含量低于模型組（P<0.05）；雞血蓮黃酮低劑量組小鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6含量均高于雞血蓮黃酮高劑量組（P<0.05）。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠降低NAFLD小鼠肝臟炎癥因子水平。（見表4）

表4 各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量比較（，μg/mL）

表4 各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量比較（，μg/mL）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雞血蓮黃酮高劑量組比較，cP<0.05

2.7 各組小鼠肝臟NF-κB表達比較 與正常組比較，模型組呈深棕色，提示NF-κB的表達量增加；雞血蓮黃酮高、低劑量組小鼠肝組織與模型組比較，棕色變淺，提示NF-κB的表達量下降。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠抑制高脂飲食誘導(dǎo)的NF-κB表達量增加。（見圖3）

圖3 各組小鼠肝臟NF-κB 表達情況

2.8 各組小鼠Sirf1和AMPK蛋白表達比較 模型組小鼠肝臟中Sirt1和AMPK表達量低于正常組（P<0.05）；雞血蓮黃酮高劑量組小鼠肝臟中Sirt1和AMPK表達量高于模型組（P<0.05）。結(jié)果表明雞血蓮黃酮能夠部分逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟中Sirt1和AMPK表達障礙。（見圖4、表5）

圖4 各組小鼠Sirf1 和AMPK 蛋白表達的比較

表5 各組小鼠Sirf1 和AMPK 蛋白表達比較（）

表5 各組小鼠Sirf1 和AMPK 蛋白表達比較（）

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討 論

NAFLD是一種臨床常見的慢性肝病，它的發(fā)生往往與肥胖、高血壓、2型糖尿病及血脂異常等因素有關(guān)。血漿中的脂質(zhì)含量與NAFLD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。NAFLD患者體內(nèi)脂代謝紊亂，一般表現(xiàn)為血漿中的TG、TC、AST、ALT水平較高[14]。高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)高脂血癥及肝臟脂代謝紊亂，引起肝細胞脂肪變性，肝臟結(jié)構(gòu)與功能受損。在本研究中，與正常組比較，模型組小鼠TC、TG、AST、ALT水平增加，說明高脂飼料可成功誘導(dǎo)小鼠脂代謝紊亂。肝臟的病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟組織中出現(xiàn)彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變和炎性細胞，說明NAFLD造模成功，且該模型屬于非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。

氧化應(yīng)激對NAFLD的發(fā)展具有促進作用。高脂、高熱量的膳食不僅能夠引起機體脂代謝異常，還能激活細胞內(nèi)還原型酰胺嘌呤二核苷酸磷酸氧化途徑，生成過量ROS，肝臟抗氧化酶活性下降，MDA含量增加，導(dǎo)致胰導(dǎo)素抵抗（IR）、炎癥和纖維化，從而導(dǎo)致NAFLD進一步惡化[15]。本研究中，高脂飲食誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟組織中MDA的含量增加，SOD、GSH-px、CAT的含量降低，表明NAFLD小鼠肝臟發(fā)生了氧化應(yīng)激事件。雞血蓮黃酮能夠增加抗氧化酶的含量，同時降低MDA的含量，進而起到減緩NAFLD的作用。

過度炎癥反應(yīng)是NAFLD的典型病理改變之一。研究表明，炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6參與了NAFLD繼發(fā)肝損傷[16-17]。在本研究中，HE染色結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)了小鼠肝臟大量的炎細胞浸潤，肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加，肝臟組織存在炎癥反應(yīng)。雞血蓮黃酮給藥后可有效抑制炎性細胞浸潤，減少TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。提示雞血蓮黃酮能夠抑制炎癥反應(yīng)，從而起到抑制NAFLD的作用。

AMPK是導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生和調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的重要因子。最近的研究報道，藥物可通過AMPK通路增強抗氧化酶活性以減輕氧化應(yīng)激[3]。AMPK通路的激活可增加Sirt1的活性。研究資料證實，Sirt1的激活能夠增加肝內(nèi)線粒體的生成，并促進肝內(nèi)超氧化物歧化酶的表達，從而提高NASH抗氧化應(yīng)激能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟組織中AMPK、Sirt1的表達下降，而雞血蓮黃酮給藥后能夠增加AMPK、Sirt1的表達。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB存在于多種細胞中，包括脂肪細胞和巨噬細胞，它是一種關(guān)鍵的氧化還原敏感的促炎性轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)多種基因的表達，肝損傷能夠?qū)е翹F-κB的上調(diào)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟組織中，NF-κB的表達量升高，而雞血蓮黃酮給藥后，NF-κB的表達下降。以上結(jié)果提示雞血蓮黃酮能夠通過調(diào)節(jié)AMPK/Sirt1/NF-κB通路，調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的脂代謝紊亂，減緩由此引發(fā)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

本研究從動物水平證實雞血蓮黃酮具有緩解NAFLD的潛力，為雞血蓮用于NAFLD治療藥物的開發(fā)，提供了實驗依據(jù)。