侯亞莉,梅 穩(wěn),郭菲菲,賀明娟,吳國瓊,林 梅,李 莉
(1.武漢市第四醫(yī)院,湖北 武漢 430032;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430030)
糖尿病腎病是糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一,如不及時進(jìn)行干預(yù)治療,可能發(fā)展為腎衰竭[1]。目前尚沒有治療糖尿病腎病的特效藥物,臨床上主要采用控制血糖等病因治療及對癥治療,所以,對于糖尿病腎病的治療藥物研發(fā)仍是當(dāng)前的臨床工作重點。TLR/NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥信號傳遞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2],近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展密切相關(guān)[3]。漢黃芩素是從黃芩等植物中提取、分離得到的單體化合物,具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用[4-5],研究報道其對糖尿病具有一定的治療作用[6]。然而,漢黃芩素對糖尿病腎病大鼠的作用及機(jī)制,目前尚未見報道。本文通過研究漢黃芩素對糖尿病腎病大鼠的血糖及腎組織TLR/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用,以期為漢黃芩素的藥理作用研究及糖尿病腎病的藥物研發(fā)提供新的思路及參考依據(jù)。
1.1 實驗動物 6周齡成年雄性SPF級SD大鼠90只,體質(zhì)量(180±20)g,購買于華中科技大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK(鄂)2016-0009,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗,動物房溫度(22±2)℃,濕度(50±10)%,實驗中采用頸椎脫臼法處死大鼠。本研究的動物實驗按照《實驗動物管理條例》進(jìn)行,嚴(yán)格遵循3R原則,且獲得本院動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)審核。
1.2 藥物與試劑 漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶科技有限公司,批號:SW8020,純度>98%);尿蛋白定量試劑盒(批號:20190826)、糖化血紅蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(批號:20191015)(南京建成生物工程研究所);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號:P0012)、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號:P0018FM)、RIPA蛋白裂解液(批號:P0013B)、SOD活性檢測試劑盒(批號:S0103)、MDA檢測試劑盒(批號:S0131M)、RNA提取試劑盒(批號:R0011)、cDNA第一鏈合成試劑盒(批號:D7168L)、TLR4兔多克隆抗體(批號:AF8187)、NF-κBp65兔多克隆抗體(批號:AF5243)、GAPDH抗體(批號:AF1186)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號:A0208)(上海碧云天生物科技有限公司);大鼠高脂飼料(普通飼料中置入10%豬油、2.5%膽固醇以及1%膽酸鈉)(上海銳賽生物技術(shù)有限公司,批號:20190606)。
1.3 主要儀器 IX83熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);Sigma 8K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);K3酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司);ChemiDoc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)。
1.4 造模與分組 90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組,糖尿病腎病組,二甲雙胍組及漢黃芩素低、中、高劑量組,每組15只。除對照組,其余大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)的同時腹腔注射給予大鼠STZ溶液,50 mg/只,連續(xù)5 d[7-8],以大鼠血糖大于11.1 mmol/L,血清BUN及SCr水平升高及腎組織發(fā)生病理學(xué)改變視為造模成功。對照組給予大鼠普通飼料并腹腔注射等量的生理鹽水。
1.5 實驗給藥 漢黃芩素低、中、高劑量組大鼠參照文獻(xiàn)方法[8],按照人給藥劑量的6.3倍給藥,灌胃給予大鼠50、100、200 mg/kg的漢黃芩素,二甲雙胍組大鼠灌胃給予二甲雙胍溶液,200 mg/kg,對照組及糖尿病腎病組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水,1次/d,給藥12周[8]。
1.6 觀察指標(biāo)
1.6.1 大鼠24 h尿量及尿蛋白量 所有大鼠末次給藥24 h后,連續(xù)3 d收集24 h尿液,測定尿量,使用大鼠尿蛋白ELISA檢測試劑盒測定各組大鼠24 h尿蛋白量。
1.6.2 空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清BUN及SCr水平 每組取6只大鼠,禁食12 h,尾靜脈取血,使用血糖儀檢測空腹血糖,眼眶靜脈叢取血使用ELISA試劑盒檢測大鼠糖化血紅蛋白水平,腹主動脈取血用全自動生化分析儀檢測血清BUN、SCr水平。
1.6.3 大鼠腎組織SOD活性及MDA水平的測定 大鼠處死后分離腎組織,使用生理鹽水灌流清除血液,取腎組織樣品,加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行研磨勻漿,4 ℃,3 500 r/min離心10 min,取上清液,使用ELISA試劑盒檢測大鼠SOD活性及MDA水平。
1.6.4 大鼠腎組織病理學(xué)檢查 每組取6只大鼠,切除腎臟,將一半腎臟于4%中性甲醛中固定12 h,在石蠟包埋機(jī)中包埋后切成5 μm厚的切片,然后行常規(guī)HE染色。
1.6.5 實時定量PCR檢測大鼠腎組織TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平 每組取6只大鼠,使用Trizol從新鮮分離的大鼠腎組織中提純總RNA,cDNA合成試劑盒獲得第一鏈cDNA,用SYBR green SuperMix進(jìn)行定量PCR反應(yīng),結(jié)果采用2-△△Ct法以GAPDH為內(nèi)參,計算表達(dá)量。引物序列見表1。
表1 基因引物序列
1.6.6 Western blotting檢測大鼠腎組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平 每組取6只大鼠腎組織,加入組織裂解液后勻漿,離心分離上清,使用10% SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,使用5%脫脂干奶在4°C封閉1 h,然后經(jīng)TLR4、NF-κBp65及GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體及山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)孵育,用化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像儀中成像,以GAPDH為內(nèi)參,使用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行定量分析。
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白量比較 與對照組比較,糖尿病腎病組大鼠24 h尿量明顯降低(P<0.05),24 h尿蛋白量明顯升高(P<0.05);與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠24 h尿量明顯升高(P<0.05),24 h尿蛋白量明顯降低(P<0.05)。(見圖1)
圖1 各組大鼠24 h 尿量及尿蛋白量比較(,n=15)
2.2 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較 與對照組比較,糖尿病腎病組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均明顯升高(P<0.05),提示造模成功;與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均明顯降低(P<0.05)。(見圖2)
圖2 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平(,n=6)
2.3 各組大鼠血清BUN及SCr水平比較 與對照組比較,糖尿病腎病組大鼠血清BUN及SCr水平明顯升高(P<0.05),提示造模成功;與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清BUN及SCr水平明顯降低(P<0.05)。(見圖3)
圖3 各組大鼠血清BUN 及SCr 水平(,n=6)
2.4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA水平比較 與對照組比較,糖尿病腎病組大鼠腎組織SOD活性明顯降低(P<0.05),MDA水平明顯升高(P<0.05);與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織SOD活性明顯升高(P<0.05),MDA水平明顯降低(P<0.05)。(見圖4)
圖4 各組大鼠腎組織SOD 活性及MDA 水平(,n=6)
2.5 各組大鼠腎組織病理學(xué)檢查 對照組大鼠腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,未見明顯組織病理學(xué)變化;糖尿病腎病組大鼠腎小球萎縮,腎小管擴(kuò)張,腎間質(zhì)纖維化,并可見大量炎性細(xì)胞浸潤及壞死細(xì)胞脫落;漢黃芩素組及二甲雙胍組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù),腎小管擴(kuò)張減輕,偶見炎性細(xì)胞浸潤及壞死細(xì)胞脫落。(見圖5)
圖5 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變(HE,×200)
2.6 各組大鼠腎組織TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平比較 與對照組比較,糖尿病腎病組大鼠腎組織TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平均明顯升高(P<0.05);與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平均明顯降低(P<0.05)。(見圖6)
圖6 各組大鼠腎組織TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA 水平(,n=6)
2.7 各組大鼠腎組織TLR4及NF-κBp65蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較,糖尿病腎病組大鼠腎組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。(見圖7)
圖7 各組大鼠腎組織TLR4 及NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平(,n=6)
糖尿病腎病是由糖尿病引起的腎臟疾病,是糖尿病患者的常見并發(fā)癥之一。糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)有少尿、蛋白尿、血肌酐升高等典型腎功能損害癥狀,其發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、腎臟血流動力學(xué)改變、糖代謝異常、高血壓等多種因素有關(guān)[9-10]。糖尿病腎病若不及時進(jìn)行干預(yù),可能進(jìn)展為終末期腎衰竭,需要進(jìn)行透析治療。目前對于糖尿病腎病的治療,臨床上主要采用控制血糖、血壓等病因治療的手段。
漢黃芩素是從唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi以及滇黃芩Scutellaria amoena C.H.Wright等植物的根中提取得到的單體化合物?,F(xiàn)代研究表明[11-12],漢黃芩素具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、擴(kuò)血管及肺組織保護(hù)等多種藥理作用。近年來有文獻(xiàn)報道[6,13],漢黃芩素對糖尿病具有一定的治療作用。侯亞莉等[6]發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖,改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變;劉洋等[13]發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠顯著緩解鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖和低胰島素血癥。
TLR是機(jī)體組織細(xì)胞參與非特異性免疫的一類蛋白質(zhì)分子,能夠激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答,并誘導(dǎo)機(jī)體炎癥因子的產(chǎn)生,參與體內(nèi)炎癥信號的傳遞[14-15]。NF-κB是組織細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對炎癥因子、輻射、病毒等信號的應(yīng)激反應(yīng)[16-17]。然而TLR/NF-κB信號通路及相關(guān)蛋白的異常激活會引發(fā)自身免疫疾病、慢性炎癥及腫瘤等多種疾病。任凌燕等[18]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與TLR/NF-κB信號通路的異常激活有關(guān),抑制TLR/NF-κB信號通路能夠改善糖尿病腎病小鼠的腎功能;張正菊等[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃素能夠緩解糖尿病小鼠的炎癥損傷,其機(jī)制與抑制TLR/NF-κB信號通路有關(guān)。
在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中,血糖水平的升高通過影響線粒體呼吸鏈多種途徑,使體內(nèi)氧自由基生成增加,發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[20]。同時,血糖波動能夠通過加重機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而加速糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展,其中SOD及MDA水平是氧化應(yīng)激反應(yīng)活化的標(biāo)志[21]。對于糖尿病腎病患者,由于其腎小球足細(xì)胞損傷,使腎小球濾過功能降低,導(dǎo)致尿量減小及尿蛋白升高等病理變化[22]。尿素是體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物,其主要經(jīng)過腎臟排泄[23];肌酐作為肌肉代謝的主要產(chǎn)物,其同樣經(jīng)過腎臟排出體外[24];當(dāng)腎功能下降,腎小球濾過率降低時,血清BUN及SCr則會明顯升高,故BUN及SCr作為腎實質(zhì)受損的重要標(biāo)志,在評價腎功能方面具有重要意義[25]。糖化血紅蛋白水平是反映近期3個月內(nèi)機(jī)體血糖的平均水平,與空腹血糖檢測相比,糖化血紅蛋白則較好地反映出機(jī)體長期較為穩(wěn)定的血糖水平,避免了應(yīng)激狀態(tài)及飲食因素的影響[26]。本實驗通過建立糖尿病腎病大鼠模型,研究漢黃芩素對糖尿病腎病大鼠的作用及機(jī)制。結(jié)果表明,與糖尿病腎病組比較,漢黃芩素組大鼠24 h尿量及腎組織SOD活性明顯升高,24 h尿蛋白量、空腹血糖、糖化血紅蛋白水平、血清BUN水平及血清SCr水平、腎組織MDA水平明顯降低,提示漢黃芩素能夠改善糖尿病腎病大鼠的腎功能及氧化應(yīng)激損傷,緩解糖尿病腎病的進(jìn)展,同時,漢黃芩素組大鼠腎組織TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平及TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平均明顯降低,提示漢黃芩素能夠抑制糖尿病腎病大鼠體內(nèi)TLR/NF-κB信號通路的異常激活,進(jìn)而發(fā)揮其腎組織保護(hù)作用??梢钥闯?,漢黃芩素對于糖尿病腎病大鼠的改善作用表現(xiàn)在血糖控制、腎功能改善及病理學(xué)恢復(fù)等多個方面。根據(jù)各個指標(biāo)在糖尿病腎病發(fā)病中的特殊意義,推測漢黃芩素能夠通過抑制糖尿病腎病大鼠腎組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平,進(jìn)而有效地控制了腎組織炎癥反應(yīng)通路的傳遞,阻止腎組織進(jìn)一步氧化損傷,恢復(fù)腎小球形態(tài)及功能,從而發(fā)揮對糖尿病腎病的治療作用。由于時間等因素的限制,本實驗未能考慮漢黃芩素與臨床常用的降血糖藥物合用時對糖尿病腎病大鼠腎組織TLR/NF-κB信號通路及其上、下游相關(guān)蛋白的影響,擬在今后的研究中將對其進(jìn)行深入探討。
綜上所述,漢黃芩素能夠顯著改善糖尿病腎病大鼠腎功能及血糖水平,減輕大鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷及病理學(xué)變化,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR/NF-κB信號通路有關(guān)。