張琦君，鄧海濱，車(chē) 勇，殷書(shū)敏，徐振曄

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院，上海 200434；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

肺癌屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)中“肺積”范疇，臨床觀察晚期肺癌患者常出現(xiàn)神疲乏力、形體消瘦、腰膝酸軟、少氣懶言、頭暈耳鳴、氣短而喘、自汗盜汗等肺腎精虧表現(xiàn)，徐振曄教授將其病機(jī)歸納為“精氣虧虛，癌毒內(nèi)蘊(yùn)”，治療上注重養(yǎng)精補(bǔ)腎，輔以益氣健脾，協(xié)同抗癌解毒之品祛邪，研制“益氣養(yǎng)精，解毒散結(jié)”中藥復(fù)方——肺巖寧方。全方生黃芪補(bǔ)氣溫陽(yáng)，白術(shù)甘溫健脾，兩藥相合，補(bǔ)肺脾腎之虛；黃精益精填髓，淫羊藿合山茱萸補(bǔ)腎溫陽(yáng)，三藥相合，陰陽(yáng)并補(bǔ)，陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰；石見(jiàn)穿、山慈菇、蜂房、七葉一枝花、干蟾皮解毒散結(jié)，祛邪抗癌，諸藥相合，攻補(bǔ)兼施、益氣養(yǎng)精、解毒散結(jié)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肺巖寧方使肺癌患者生存期、臨床癥狀方面獲益明顯[1]；基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)其不僅能多靶點(diǎn)抗腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[2]，還有調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的作用，能降低肺癌患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、下調(diào)Foxp3 mRNA表達(dá)[3]及調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞失衡[4]。在腫瘤免疫微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）作為主要的間質(zhì)細(xì)胞之一，在包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中，其含量增高與腫瘤局部浸潤(rùn)、血管生成、缺氧、早期轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]，已成為現(xiàn)今腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)之一，因此本研究進(jìn)一步探討肺巖寧方對(duì)腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化的影響，為其治療肺癌的機(jī)制提供新的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)C57BL/6純系雄性小鼠36只，體質(zhì)量（20±2）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SYXK（滬）-2014-008。小鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫（25±2）℃，采用食飼料飼養(yǎng)方式，自由進(jìn)食與飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，采用2%異氟烷吸入麻醉后，斷頸處死動(dòng)物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理相關(guān)規(guī)范，倫理編號(hào)：PZSHUTCM190628010。

1.2 細(xì)胞株 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 藥物與試劑 肺巖寧方組方：生黃芪30 g，白術(shù)9 g，石見(jiàn)穿30 g，山慈菇12 g，蜂房9 g，干蟾皮6 g，淫羊藿15 g，黃精30 g，山茱萸15 g，靈芝15 g，七葉一枝花9 g，14劑中藥共計(jì)生藥2 520 g，于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化水煎提，水煎液經(jīng)醇提后將藥物濃縮至生藥含量為2 g/mL，-80 ℃保存?zhèn)溆?。超敏聚合酶免疫化學(xué)檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190315）、IL-4 ELISA試劑盒（批號(hào)：20190315）、IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)：20190315）（上海司鼎生物科技有限公司）；CD68抗體（貨號(hào)：A15037）（abclone公司）；CD206抗體（貨號(hào)：ab64693）、PD-1抗體（貨號(hào)：ab214421）、PD-L1抗體（貨號(hào)：ab238697）（abcam公司）；PI3K抗體（貨號(hào)：5405S）、C/EBPβ抗體（貨號(hào)：3082S）（CST公司）。

1.4 主要儀器 DMI3000B熒光倒置顯微鏡（Leica公司）；RM2235型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；HS1125型組織攤片機(jī)（浙江省金華市華速科技有限公司）；5810R型冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；F50型酶標(biāo)檢測(cè)儀（Tecan公司）；1645050型電泳儀（BIO-RAD公司）；V370型掃描儀（EPSON公司）。

1.5 造模與分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法取16只C57BL/6小鼠分為正常對(duì)照組、正常肺巖寧組，每組8只。取余下20只C57BL/6小鼠進(jìn)行造模，造模方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，消化、離心、重懸后制備成細(xì)胞密度為5.0×106/mL的細(xì)胞懸液，取0.2 mL注射于C57BL/6小鼠右腋部皮下，建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型，接種7 d后可觸及瘤塊即判定為造模成功。20只小鼠中有4只造模未成功，余下16只荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組和模型肺巖寧組，每組8只。

1.6 實(shí)驗(yàn)給藥 造模成功后開(kāi)始給藥干預(yù)，給藥劑量根據(jù)人鼠體表面積折合法計(jì)算，約成人劑量的9倍[6]。正常肺巖寧組、模型肺巖寧組小鼠灌胃給予肺巖寧方，40 g/（kg·d）。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)2周。末次灌胃禁食12 h后眼球采血，斷頸處死，迅速剝離瘤體，分別保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 抑瘤率 剖取小鼠皮下瘤組織，電子天平稱(chēng)取瘤質(zhì)量后分為兩部分，分別用于病理和Western blotting檢測(cè)標(biāo)本。病理檢測(cè)標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，Western blotting標(biāo)本于檢測(cè)-80 ℃液氮中保存。根據(jù)抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%，計(jì)算抑瘤率。

1.7.2 免疫組化法檢測(cè)瘤組織CD68、CD206表達(dá)情況 排除有壞死液化、增生肉芽的瘤體，最后每組取6只瘤體進(jìn)行檢測(cè)，將瘤組織置于多聚甲醛固定制作石蠟切片，將切片放置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟各15 min，再依次放入無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇中脫水各5 min，蒸餾水沖洗2次后置于含EDTA抗原修復(fù)緩沖液中，PBS洗滌3次后放入3%H2O2中室溫避光孵育25 min，滴加3%BSA室溫封閉30 min，滴加稀釋濃度分別為1∶200、1∶400的一抗（CD68、CD206）4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗室溫孵育50 min，PBS洗滌3次后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色，蘇木素復(fù)染3 min，1%的鹽酸乙醇分化5 s，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗后依次放入75%乙醇、85%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ中各6 min，再放入二甲苯Ⅰ中脫水5 min，切片晾干后中性樹(shù)膠封片。染色后以CD68、CD206抗體在細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。于龍華醫(yī)院腫瘤研究所病理成像系統(tǒng)下采集組織切片圖像，于鏡下無(wú)特異性著色的不同區(qū)域，隨即拍攝4個(gè)200倍鏡視野，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行CD68、CD206的平均光密度值（陽(yáng)性面積%）計(jì)算，陽(yáng)性面積%=IOD值/陽(yáng)性面積。

1.7.3 ELISA法檢測(cè)血清IL-4、IL-10含量 使用1.5 mL EP管收集各組小鼠血液標(biāo)本，4 ℃3 000 r/min離心20 min，收集血清，2～8 ℃保存，48 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)IL-4、IL-10試劑盒中步驟操作，計(jì)算出血清IL-4、IL-10含量。

1.7.4 Western blotting檢測(cè)瘤組織PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1表達(dá)情況 每組隨機(jī)取3只小鼠瘤體進(jìn)行檢測(cè)，提取瘤組織總蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次后加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后顯影曝光，圖像掃描。采用Image J圖像分析軟件計(jì)算條帶灰度值，將目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參灰度值對(duì)比表示目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析LSD-t法檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抑瘤率 模型肺巖寧組小鼠瘤質(zhì)量明顯低于模型對(duì)照組（P<0.05），抑瘤率為60.59%。（見(jiàn)表1）

表1 兩組小鼠皮下瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

2.2 兩組小鼠皮下瘤組織中CD68、CD206表達(dá)情況 模型對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞膜周?chē)鶦D68顆粒染色較少，CD206顆粒染色較多，表明其腫瘤組織中CD68蛋白表達(dá)較弱，CD206蛋白表達(dá)較強(qiáng)；而模型肺巖寧組腫瘤細(xì)胞膜周?chē)鶦D68顆粒染色較多，CD206顆粒染色較少，表明其腫瘤組織中CD68蛋白表達(dá)較強(qiáng)，CD206蛋白表達(dá)較弱。（見(jiàn)圖1）

圖1 兩組小鼠皮下瘤CD68、CD206 表達(dá)情況（免疫組化，×200）

模型肺巖寧組小鼠皮下瘤免疫組化CD68的平均光密度值明顯高于模型對(duì)照組（P<0.05）；CD206的平均光密度值明顯低于模型對(duì)照組（P<0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 兩組小鼠皮下瘤免疫組化CD68、CD206 平均光密度值比較（）

表2 兩組小鼠皮下瘤免疫組化CD68、CD206 平均光密度值比較（）

2.3 各組小鼠血清IL-4、IL-10含量比較 模型對(duì)照組小鼠血清IL-4、IL-10含量明顯高于正常對(duì)照組、正常肺巖寧組（P<0.05）；模型肺巖寧組小鼠血清IL-4和IL-10含量明顯低于模型對(duì)照組（P<0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組小鼠外周血清中IL-4、IL-10 含量比較（，pg/mL）

表3 各組小鼠外周血清中IL-4、IL-10 含量比較（，pg/mL）

2.4 兩組小鼠皮下瘤組織中PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1表達(dá)情況 模型肺巖寧組小鼠皮下瘤組織中PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1表達(dá)水平明顯低于模型對(duì)照組（P<0.05）。（見(jiàn)圖2、表4）

表4 兩組小鼠皮下瘤組織中PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1 表達(dá)水平比較（）

表4 兩組小鼠皮下瘤組織中PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1 表達(dá)水平比較（）

注：與模型對(duì)照組比較，aP<0.05

圖2 兩組小鼠皮下瘤PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1表達(dá)情況

3 討 論

在腫瘤微環(huán)境中，圍繞腫瘤細(xì)胞為中心，腫瘤間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)形成了一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境，無(wú)時(shí)無(wú)刻不影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞（TAMs）作為腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中的主要細(xì)胞之一，在缺氧、腫瘤細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞誘導(dǎo)及各種細(xì)胞因子的作用下發(fā)生表型改變，對(duì)腫瘤產(chǎn)生雙重作用[7]。TAMs根據(jù)其功能可分為M1型（經(jīng)典激活，classically activated）及M2 型（選擇活化，alternatively activated）兩類(lèi)[8]。M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的促炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-12與TNF，并通過(guò)產(chǎn)生活性氮和活性氧，參與炎癥反應(yīng)，具有高度抗原提呈，高表達(dá)MHCⅡ和促進(jìn)Th1反應(yīng)的能力[9]。相反，M2型巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生少量的促炎細(xì)胞因子及大量抗炎細(xì)胞因子如IL-4、IL-10，高度表達(dá)甘露糖受體（CD206）和清道夫受體（CD163），通過(guò)精氨酸酶途徑增加鳥(niǎo)氨酸和多胺的釋放，消耗T細(xì)胞增殖所需的代謝物精氨酸，從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[10]，其功能異常激活可引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、延緩對(duì)病原體的免疫反應(yīng)等[11-12]。在腫瘤微環(huán)境中TAMs通常具有M2型，促進(jìn)Th2淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化和招募，促進(jìn)腫瘤增殖、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管生成，降低機(jī)體主動(dòng)免疫反應(yīng)，為腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移提供適宜的免疫環(huán)境[13]。TAMs的異質(zhì)性并非一成不變，其極化具有可逆性及可調(diào)節(jié)性，可隨腫瘤免疫微環(huán)境中的腫瘤免疫應(yīng)答而重塑，某些中藥單體就具有逆轉(zhuǎn)M2型TAMs向M1型轉(zhuǎn)化的作用[14]。

中醫(yī)藥整體觀念的思路與腫瘤免疫治療的理念不謀而合，通過(guò)對(duì)機(jī)體微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸的狀態(tài)，改善腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞及其功能，從而發(fā)揮抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的作用[15]。就如“種子-土壤”學(xué)說(shuō)中所闡述，腫瘤細(xì)胞如同種子，種子是否生長(zhǎng)有賴(lài)于所處土壤即腫瘤微環(huán)境是否適宜其生長(zhǎng)發(fā)展與轉(zhuǎn)移，而中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)的理念恰恰解釋了其通過(guò)對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)達(dá)到抑瘤抗轉(zhuǎn)移的目的。在本研究中，我們加入了正常肺巖寧組以觀察肺巖寧方對(duì)正常小鼠免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，檢測(cè)結(jié)果顯示與模型對(duì)照組小鼠比較，肺巖寧方灌胃后的正常小鼠外周血中免疫抑制性細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平降低，提示肺巖寧方可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，改變了“土壤”的免疫微環(huán)境，抑制了M2型TAMs生成所需的免疫抑制性細(xì)胞因子產(chǎn)生，不利于腫瘤細(xì)胞的種植、生長(zhǎng)和增殖。經(jīng)肺巖寧方干預(yù)2周后，與模型對(duì)照組比較，模型肺巖寧組小鼠皮下瘤M1型TAMs表面抗原CD68陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，M2型TAMs表面抗原CD206陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，同時(shí)降低了外周血中免疫抑制性細(xì)胞因子IL-4、IL-10的含量，提示肺巖寧方可通過(guò)對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中關(guān)鍵細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)影響TAMs極化。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞PI3Kγ信號(hào)通路在抑制NF-κB活化的同時(shí)刺激C/EBPβ活性，觸發(fā)轉(zhuǎn)錄程序從而促進(jìn)腫瘤免疫抑制，在荷瘤小鼠模型中，選擇性抑制TAMs中PI3Kγ、C/EBPβ活化可恢復(fù)CD8+T細(xì)胞毒性，并協(xié)同PD-1抑制劑發(fā)揮抑瘤作用[16]。該通路同時(shí)也影響TAMs極化，如中藥單體大黃素通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞招募及逆轉(zhuǎn)M2型TAMs生成減少乳腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與降低C/EBPβ的表達(dá)相關(guān)[17]。另有文獻(xiàn)顯示TAMs可表達(dá)PD-1、PD-L1[18]，并影響其極化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌如IL-10、IL-12等，調(diào)控TAMs表面標(biāo)志物表達(dá)[19]。中藥補(bǔ)肺湯通過(guò)下調(diào)IL-10，阻斷PD-1表達(dá)，下調(diào)CD206+TAMs，抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)[20]。本研究利用Western blotting檢測(cè)小鼠皮下瘤中PI3K、C/EBPβ、PD-1、PD-L1的表達(dá)水平，也得到了與上述文獻(xiàn)一致的結(jié)果。

綜上所述，肺巖寧方可能通過(guò)降低免疫抑制性細(xì)胞因子IL-4、IL-10分泌,抑制PI3K/C/EBPβ和PD-1/PD-L1信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤微環(huán)境中TAMs極化，促使其表型向M1型轉(zhuǎn)變，從而發(fā)揮抑瘤作用。