楊成蘭，段瑞君，武雄雄，祁存英，馬銀花，熊輝巖

（1. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

甘油脂類(lèi)是細(xì)胞膜、種子貯藏油和表皮角質(zhì)層蠟質(zhì)的主要成分，在與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基本細(xì)胞代謝和抗逆性中發(fā)揮重要作用[1]。甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是甘油脂類(lèi)代謝中催化?；鶑孽；o酶A (acyl coenzyme A, acyl-CoA)或酰基載體蛋白 (acyl-carrierprotein, acyl-ACP)轉(zhuǎn)移到甘油-3-磷酸(glycerin-3-phosphate, G3P)的sn-1 或sn-2 位 生 成 溶 血 磷 脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)的重要酶類(lèi)[2]。陸生植物GPAT 亦可利用ω-氧化脂?；?CoA 或超長(zhǎng)鏈脂?；?CoA 作為?；w催化G3P 的sn-2 脂?；磻?yīng)而形成sn-2 溶血磷脂酸(LPA) 或sn-2 單脂酰甘油(monoacylglycerol, MAG)，為角質(zhì)層角質(zhì)和軟木脂聚酯合成提供單體構(gòu)件[3]。由于角質(zhì)層和軟木脂與植物抗逆性直接相關(guān)，因此GPAT 在植物抗逆方面十分重要。

GPATs 在許多植物中均有表達(dá)，在質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體3 種不同的亞細(xì)胞中均能觀(guān)察到GPATs的活性。質(zhì)體GPAT 是可溶的，以?；鵄CP 為底物，而位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體上的GPAT 是膜結(jié)合的，以acyl-CoA 和acyl-ACP 為天然的?；w，主要參與角質(zhì)、軟木脂和貯藏脂質(zhì)的合成[4-5]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，GPAT基因家族的成員因其在受精、種子發(fā)育、脅迫耐受和角質(zhì)或亞角質(zhì)生成中的作用而被廣泛研究[6-8]。除此之外，GPATs也在各種作物中進(jìn)行了研究，包括向日葵(Helianthus annuus)[9]、水稻(Oryza sativa)[10]、番茄(Lycopersicon esculentum)[11]、玉米(Zea mays)[12]以及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)[2]。

鹽堿脅迫作為植物非生物脅迫的重要限制因子，導(dǎo)致土地鹽漬化，嚴(yán)重限制了植物的正常生長(zhǎng)[13]，從而影響了農(nóng)牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，土地鹽堿化已經(jīng)成為一個(gè)世界性的環(huán)境問(wèn)題，我國(guó)鹽堿地主要分布在東北、華北、西北及沿海地區(qū)，鹽堿地總面積約1 億hm2[13]。青海省海西柴達(dá)木地區(qū)由于氣候極端干燥，降雨少，蒸發(fā)量大，鹽離子濃度不斷升高，形成大面積鹽堿土，從而植被稀少，生態(tài)環(huán)境脆弱[14]。紫花苜蓿(Medicago sativa)因其蛋白含量豐富被稱(chēng)為“牧草之王”，可作為優(yōu)質(zhì)牧草使用，廣泛分布在我國(guó)華北、西北和東北等地區(qū)，目前已在青海省開(kāi)展推廣種植。但鹽堿化成為了制約紫花苜蓿推廣的關(guān)鍵因素之一。已有研究闡述了紫花苜蓿的抗鹽堿機(jī)制[15]，但絕大多數(shù)均是從生化角度分析，對(duì)其抗鹽堿機(jī)理的更深層的研究還不多。

蒺藜苜蓿(M. truncatula)作為豆科模式植物代表，具有基因組小、生長(zhǎng)周期短、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟等特點(diǎn)，可以較好地開(kāi)展基因功能研究，目前蒺藜苜蓿測(cè)序也已完成，可以為紫花苜蓿等近緣種研究提供指導(dǎo)。因此，本研究選用蒺藜苜蓿進(jìn)行GPAT基因家族的全基因組比較分析，包括系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)分析，從而為進(jìn)一步開(kāi)展GPAT基因在紫花苜蓿鹽脅迫中的功能研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 GPAT 基因家族成員的序列檢索與鑒定

從 Ensembl (http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蒺藜苜?；蚪M測(cè)序數(shù)據(jù)。以擬南芥的GPAT 蛋白序列為基礎(chǔ)，采用BLASTp 和HMM (E= 0.000 01)兩種方法搜索了蒺藜苜蓿的GPAT候選基因。隨后采用Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)、NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)GPAT家族的每個(gè)候選成員是否具有Pfam 的PlsC?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(PF01553)。利用在線(xiàn)ExPASy(http://web.expasy.org/)工具預(yù)測(cè)GPAT 蛋白的理論分子量(molecular weight, MW)和等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)，并 使 用 在 線(xiàn)Plant-PLoc server (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)服務(wù)器預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)

使用MEGA 7 軟件中的ClustalW 程序進(jìn)行執(zhí)行默認(rèn)參數(shù)的多序列比對(duì)，然后進(jìn)行手動(dòng)比較和細(xì)化。采用鄰域連接(Neighbor-Joining, NJ)方法構(gòu)建不同的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參數(shù)采用成對(duì)刪除選項(xiàng)、泊松修正模型和均勻率。Bootstrap 檢驗(yàn)設(shè)定1000 次重復(fù)，以評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的統(tǒng)計(jì)可靠性。此外，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建中還應(yīng)用了極大似然法，以驗(yàn)證與NJ 法的一致性。

1.3 染色體定位

根據(jù)基因組注釋文件中提供的位置信息，將所有蒺藜苜蓿GPAT基因定位到相應(yīng)的染色體上。Mapchartv 2.2 軟件用于繪制苜蓿GPAT基因的染色體定位圖，利用AI 工具對(duì)其進(jìn)行美化。

1.4 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

使用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線(xiàn)預(yù)測(cè)GPAT基因結(jié)構(gòu)；使用MEME (http://memesuite.org/tools/meme)工具預(yù)測(cè)該基因的保守基序位置。最后用TBtools v1.0983 軟件進(jìn)行可視化。

1.5 mtGPAT 家族基因的表達(dá)分析

在基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)中分別下載蒺藜苜蓿的不同組織表達(dá)數(shù)據(jù)(E-MEXP-1097)和200 mmol·L?1鹽脅迫下的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(E-GEOD-13907)。在蒺藜苜蓿基因表達(dá)圖譜服務(wù)器(http://mtgea.noble.org/v2/) 中找出mtGPAT各基因的探針編號(hào)，根據(jù)各基因的探針編號(hào)找出對(duì)應(yīng)的表達(dá)量，取log2 值在TBtools v1.0983 軟件上作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿GPAT 基因的鑒定、注釋和染色體定位

通過(guò)hmm search 查找GPAT 結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型、擬南芥GPAT 蛋白同源比對(duì)以及Pfam 檢查保守結(jié)構(gòu)域的方式，從蒺藜苜?；蚪M(https://genome.jgi.doe.gov/)中鑒定出24 個(gè)GPAT 家族蛋白，按其在染色體上的位置依次命名(mtGPAT1－mtGPAT24)(表1)。使用ExPASy 工具對(duì)這24 個(gè)蛋白的分子量、等電點(diǎn)等性質(zhì)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：GPAT基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸長(zhǎng)度在282 (AET03510)～568(AES60108) aa。除了KEH33585 和AES95759 蛋白的等電點(diǎn)較低(7.17 和7.14)之外，其余22 個(gè)蛋白的等電點(diǎn)均集中在8.16～10.35，因此，mtGPAT基因大都屬于堿性氨基酸。mtGPAT 蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，它們大部分均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體和葉綠體中，AES67682和KEH19006兩個(gè)基因在細(xì)胞膜上也有分布，表明這兩個(gè)基因很可能具有其他的生物學(xué)功能。

表1 蒺藜苜蓿mtGPAT 基因家族的鑒定及特性研究Table 1 Identification and characteristics of the mtGPAT gene family in Medicago truncatula

2.2 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化

為分析24 個(gè)蒺藜苜蓿mtGPAT基因的進(jìn)化關(guān)系，以及這些基因與10 個(gè)功能已被深入闡明的擬南芥AtGPAT基因間的同源關(guān)系，利用MEGA 7 軟件選用鄰域連接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。結(jié)果表明：24 個(gè)蒺藜苜蓿mtGPAT基因可以分成3 個(gè)(Group 1、Group 2、Group 3)亞家族，分別含有10、4、10 個(gè)GPAT基因家族成員。這與其他植物上的分類(lèi)相同，擬南芥中也將10 個(gè)GPAT基因分成3 個(gè)亞家族(AtGPAT1－AtGPAT8、AtGPAT9和AtS1) ， 其中AtS1是質(zhì)體型GPAT，AtS1缺失會(huì)伴隨著植物生長(zhǎng)延遲和種子發(fā)育中止，蒺藜苜蓿GPAT 蛋白成員有10 個(gè)屬于這一亞家族。AtGPAT9 可能是一種功能酶，在植物膜和貯藏脂質(zhì)生物合成中起著重要作用，這一亞族有4個(gè)mtGPAT基因。AtGPAT1－AtGPAT8均可能具有sn-2 ?；D(zhuǎn)移活性，可以為角質(zhì)和軟木脂聚酯合成提供單體構(gòu)件，由于角質(zhì)層和軟木脂與植物抗逆性直接相關(guān)，因此有10 個(gè)mtGPAT會(huì)直接參與蒺藜苜蓿的抗逆過(guò)程。

圖1 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 1 Phylogenetic analysis of the GPAT gene family in Medicago truncatula

2.3 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族染色體定位

mtGPAT基因的分布由其染色體位置決定，24 個(gè)mtGPAT基因被定位到蒺藜苜蓿的7 條染色體上，且這24 個(gè)基因均不存在成簇現(xiàn)象(圖2)。除chr1、chr5 和chr7 號(hào)染色體上分布有4～5 個(gè)基因外，其余所有染色體上均分布有2 或3 個(gè)mtGPAT基因，表明它們總體上較為一致，分布較為松散。

圖2 蒺藜苜蓿mtGPAT 基因的染色體分布Figure 2 Chromosomal distribution of mtGPAT genes in Medicago truncatula

2.4 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族成員保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步了解mtGPAT 蛋白的分類(lèi)與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，本研究預(yù)測(cè)了mtGPAT 蛋白的保守基序和基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果(圖3) 表明：24 個(gè)mtGPAT 成員大致分成了3 簇 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，同一亞家族似乎具有相似的基序，保守基序Motif 4、Motif 8 和Motif 17編碼PlsC acyltransferase 結(jié)構(gòu)域。Ⅰ簇共有的PlsC acyltransferase 結(jié)構(gòu)域保守基序?yàn)镸otif 4，基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，僅有1～3 個(gè)外顯子；Ⅱ簇中有2 個(gè)基因的PlsC acyltransferase 結(jié)構(gòu)域保守 基 序 是Motif 4，有3 個(gè)基因的保守基序是Motif 17；Ⅲ簇中mtGPAT24沒(méi)有與其他23 個(gè)基因相同的基序，可能與其序列太短有關(guān)。mtGPAT21基因PlsC acyltransferase 結(jié)構(gòu)域的保守基序?yàn)镸otif 17，其余6 個(gè)基因的保守基序均是Motif 4；Ⅱ、Ⅲ簇基因結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，外顯子數(shù)量較多，表明其親緣關(guān)系較近。

圖3 蒺藜苜蓿mtGPAT 進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析Figure 3 Phylogenetic, gene structure, and conserved motif analyses of mtGPAT genes in Medicago truncatula

在蒺藜苜?；虮磉_(dá)圖譜服務(wù)器(http://mtgea.noble.org/v2/)中找mtGPAT家族成員的探針時(shí)發(fā)現(xiàn)除 了KEH33585、AES96960 和AES97896 這3 個(gè) 基因的探針編號(hào)找不到之外，其余21 個(gè)基因均可找到各自的探針編號(hào)。根據(jù)探針編號(hào)將21 個(gè)基因在不同組織部位和鹽脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)(相對(duì)表達(dá)量)取log2 值后作組織表達(dá)圖(圖4)。不同組織部位的表達(dá)結(jié)果顯示，找出探針的21 個(gè)基因大致分成了3 簇，第1 簇各基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量相比于其他兩個(gè)簇均較高。第2 簇中mtGPAT8、mtGPAT18和mtGPAT10在花中表達(dá)量相對(duì)較高；第3 簇mtGPAT11在根、莖、葉、根瘤和葉芽中表達(dá)量較低，mtGPAT7、mtGPAT24和mtGPAT23在葉中表達(dá)量均較低。同時(shí)21 個(gè)基因在芽中均幾乎不表達(dá)。

圖4 21 個(gè)mtGPAT 基因在蒺藜苜蓿中的表達(dá)模式Figure 4 Expression patterns of the 21 mtGPAT genes in Medicago truncatula

2.5 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族在不同組織和鹽脅迫下的表達(dá)分析

根 據(jù) 蒺 藜 苜 蓿 幼 苗 在200 mmol·L?1NaCl 脅 迫下的表達(dá)圖(圖4)，可以看出，21 個(gè)基因也分成了3 簇。第1 簇4 個(gè)成員表達(dá)量均較低，但對(duì)鹽脅迫響應(yīng)比較明顯，mtGPAT3在脅迫1 h 后表達(dá)量明顯上調(diào)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量有所下降，但也明顯比對(duì)照組高；mtGPAT5分別在脅迫處理2 和10 h時(shí)表達(dá)量顯著升高(P< 0.05)；mtGPAT11在脅迫12 h后表達(dá)量顯著上調(diào)(P< 0.05)。其他兩個(gè)簇基因表達(dá)量均較高，但只有極個(gè)別基因的表達(dá)量在脅迫前后有較微弱的變化，大多數(shù)基因的表達(dá)量在脅迫前后均無(wú)明顯變化。

3 討論與結(jié)論

甘油脂類(lèi)在植物生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗鼈兪羌?xì)胞膜的主要成分、種子發(fā)育過(guò)程中的貯藏脂質(zhì)以及植物器官表皮表面的保護(hù)性疏水屏障[12]。此外，甘油脂質(zhì)還與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的抗性有關(guān)[16]。為進(jìn)一步了解GPAT 在甘油脂質(zhì)生物合成和不同生理過(guò)程中的作用，了解GPAT 的進(jìn)化歷史和多樣性是非常必要的。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，24 個(gè)mtGPAT基因可分為3 個(gè)亞家族(Group 1、Group 2、Group 3)，這與擬南芥10 個(gè)GPAT基因(AtGPAT1-8、AtGPAT9和AtS1)的分類(lèi)相似。目前對(duì)擬南芥中大多數(shù)GPAT基因的功能進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定和表征，擬南芥質(zhì)體型Ats1 是一種可溶性和質(zhì)體定位的GPAT 酶，通過(guò)利用?；鵄CP 底物催化擬南芥葉綠體中磷脂酰甘油生物合成的第一反應(yīng)，并且表現(xiàn)出sn-1 ?；D(zhuǎn)移區(qū)域特異性[12]。擬南芥質(zhì)體可溶性GPAT 的酰基底物偏好(即飽和和不飽和?；鵄CPs)可能通過(guò)介 導(dǎo) 磷 脂 酰 甘 油(phosphatidyl-glycerol PG)sn-1 位 置的脂肪酸組成部分地控制植物的耐寒性，因此影響植物氣生組織膜流動(dòng)性[17]，但其在苜蓿中的作用還有待研究，后續(xù)可以基于本研究中鑒定分類(lèi)的10 個(gè)Ⅲ型質(zhì)體型mtGPAT基因開(kāi)展試驗(yàn)。擬南芥GPAT9在植物膜和貯藏脂肪生物合成中起著重要作用，GPAT9還具有sn-1 ?；D(zhuǎn)移酶活性，對(duì)?；衔锞哂懈叨忍禺愋裕瑥亩C實(shí)了其在種子三酰甘油(TAG)生物合成中的作用，并提供了全面的證據(jù)支持其在葉片極性和非極性脂質(zhì)以及花粉中脂滴產(chǎn)生中的作用[5]，本研究中4 個(gè)II 型mtGPAT基因歸類(lèi)為GPAT9，與其可能存在相似的功能。擬南芥8 種GPAT(GPAT1-8) 不需要用于膜或貯藏脂肪的生物合成，但可能影響擬南芥[1]、甘藍(lán)型油菜[2]和水稻[10]角質(zhì)或軟木脂的組成和數(shù)量。而軟木脂和角質(zhì)是由某些植物細(xì)胞沉積的細(xì)胞外脂質(zhì)屏障。它們對(duì)于控制氣體、水和離子通量至關(guān)重要，是保護(hù)植物免受病原體入侵的物理屏障[12]。GPAT1-8中GPAT4和GPAT8被證明是葉片角質(zhì)形成所必需的[18]，GPAT6是花角質(zhì)合成所必需的[19]，GPAT5已被證明參與了根和種子中軟木脂的合成[6]。本研究I 型mtGPAT22與GPAT4和GPAT8聚在一起表明其與葉片角質(zhì)形成有關(guān)，mtGPAT10、mtGPAT18跟GPAT6聚在一起，說(shuō)明它們會(huì)參與花角質(zhì)的形成過(guò)程。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化表明與GPAT5相近的mtGPAT3、mtGPAT16有可能在苜蓿根和種子軟木脂合成中發(fā)揮重要作用。

鹽脅迫是一種主要限制世界各地作物產(chǎn)量的非生物脅迫，植物GPAT基因參與鹽脅迫過(guò)程[20]，同時(shí)GPAT基因在植物中的過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)其耐鹽性或耐寒性。先前在棉花(Gossypiumspp.)中的研究表明：在中度鹽脅迫下，大多數(shù)GhGPAT基因在根中表達(dá)上調(diào)，而在葉片中只發(fā)現(xiàn)少量的GPAT基因表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)果證實(shí)了根系是直接響應(yīng)鹽脅迫的第一組織[21]。在擬南芥AtGPAT6、AtGPAT7和AtGPAT93 個(gè)GPAT基 因 的 研 究 中，AtGPAT6和AtGPAT7可以主動(dòng)調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)[22]。本研究中，在200 mmol·L?1NaCl 脅迫蒺藜苜蓿幼苗的情況下，大多數(shù)mtGPAT基因的表達(dá)量均較高，并且不會(huì)隨著脅迫時(shí)間的變化有明顯的上調(diào)或下調(diào)，只有mtGPAT3、mtGPAT5、mtGPAT113 個(gè)基因在脅迫時(shí)間變長(zhǎng)后表達(dá)量有較微弱的上調(diào)。與擬南芥AtGPAT6和AtGPAT7聚到一起的4 個(gè)蒺藜苜?；騧tGPAT10、mtGPAT18、mtGPAT3和mtGPAT16會(huì)隨著鹽脅迫時(shí)間的不同表達(dá)量有所不同，對(duì)鹽脅迫響應(yīng)明顯。

綜上所述，本研究提供了蒺藜苜蓿GPAT基因比較全面的基因組分析，包括系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性、基因表達(dá)和耐鹽性分析。這些結(jié)果有助于人們更好地了解GPAT基因的進(jìn)化史，并對(duì)蒺藜苜蓿GPAT基因的功能有更深入的了解。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，蒺藜苜蓿GPAT基因可分為3 個(gè)不同的亞家族(Group 1、Group 2、Group 3)，進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)诨蚪Y(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)性質(zhì)、基序出現(xiàn)和基因表達(dá)模式等方面的保守性和變異性。蒺藜苜蓿作為豆科模式植物代表，同時(shí)也是紫花苜蓿等物種的近緣物種，本研究結(jié)果可為后續(xù)研究紫花苜蓿GPAT基因的功能提供基礎(chǔ)資料，以便更深入闡述紫花苜蓿的抗鹽堿機(jī)制。