劉國輝，李美雎，朱瑞娟，陳海娟，尚 軍

(1.西寧市園林植物園，青海 西寧 810008；2.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008)

紅外光譜又稱分子振動轉(zhuǎn)動光譜，是由于分子發(fā)生振動能級的躍遷所產(chǎn)生的。紅外光譜技術(shù)是現(xiàn)代用來檢測有機(jī)物分子結(jié)構(gòu)的研究和化學(xué)組成的分析的一種常用技術(shù)。能夠反映樣品的綜合信息，定性和定量分析有機(jī)物，具有樣品處理簡單，檢測試樣用量少，不損壞樣品，檢測速度快，靈敏度高，檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。已經(jīng)成為中藥鑒別、中藥炮制等最常用和不可或缺的一種檢測工具[1]。在分析化學(xué)、結(jié)構(gòu)化學(xué)中也普偏使用。紅外光譜由于在中藥質(zhì)量控制研究中的指紋信息量大、特征性強(qiáng)，而被更多的應(yīng)用于中藥指紋圖譜的構(gòu)建[2，3]。實(shí)驗(yàn)通過測定采自青海省互助縣北山、互助縣佑寧寺、瑪沁縣軍功幫菜、湟中縣丹麻、民和縣七里寺、貴南縣城邊和果洛州軍功和瑪可河地區(qū)產(chǎn)寬葉羌活的一維紅外光譜及二階導(dǎo)數(shù)光譜，采用相關(guān)性分析、主成分分析以及聚類分析，構(gòu)建青海不同產(chǎn)地寬葉羌活紅外光譜指紋圖譜[4，5]，為寬葉羌活藥材鑒定及質(zhì)量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與藥材來源 8種寬葉羌活藥材均采挖于青海省不同的地方，分別為互助北山、果洛軍功、瑪可河、幫菜和湟中、佑寧寺、民和、貴南；藥材粉碎后過60目篩，密閉保存?zhèn)溆?。溴化? KBr，光譜純)碎晶購于天津博君科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

傅立葉變換紅外光譜儀為Spectrum Two(美國Perkin Elmer公司)；

YP-2壓片機(jī)(上海山岳科學(xué)儀器有限公司)；

電子天平METTLER TOLEDO (XP205 DeltaRange)；

其它：瑪瑙研缽。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 取已粉碎處理后的藥材粉末與完全干燥的溴化鉀粉末約1∶200進(jìn)行壓片，以溴化鉀壓片作為空白對照。

1.2.2 儀器測試條件 一維紅外光譜的掃描范圍為4 000～450 cm-1，分辨率為4 cm-1，累加掃描64次，掃描過程中實(shí)時扣除二氧化碳和水蒸氣干擾。

1.2.3 精密度的測定 取處理后的互助北山樣品連續(xù)測定5次，所得紅外圖譜完全一致，譜圖的相關(guān)性為0.999，RSD值為0.000%，表明儀器精密度良好。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 使用在互助北山采取的樣品，按供試品制備方法平行制備5份，分別測定，所得紅外光譜圖比較一致，譜圖的相關(guān)系數(shù)為0.962，RSD值為2.390%，表明方法重復(fù)性良好。

1.2.5 一維紅外光譜的測定 先取空白片于紅外光譜儀中掃描，得空白片的一維紅外光譜。再將樣品片于紅外光譜儀中掃描，得到樣品片的一維紅外光譜。

1.2.6 一維紅外光譜的標(biāo)準(zhǔn)化 將收集得到的一維紅外光譜進(jìn)行坐標(biāo)轉(zhuǎn)化(縱坐標(biāo)為吸光度)，基線校正，光譜歸一化，得到標(biāo)準(zhǔn)圖譜。儀器自動識別紅外光譜峰的閾值設(shè)為0.01A(峰強(qiáng))。

1.2.7 二階導(dǎo)數(shù)光譜計(jì)算 對已標(biāo)準(zhǔn)化的一維紅外光譜計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)，13點(diǎn)平滑，即得二階導(dǎo)數(shù)光譜。儀器自動識別峰的閾值設(shè)為0.0005A(峰強(qiáng))。

2 結(jié)果

2.1 寬葉羌活一維光譜分析

產(chǎn)自8個不同地區(qū)寬葉羌活植物藥材的一維紅外光譜比較主要吸收峰位3 437～3 402、2 929～2 925、2 856～2 854、1 740～1 718、1 688～1 626、1 516～1 513、1 456～1 423、1 323、1 260～1 257、1 168～1 121、1 075～1 029、876、536～530、473 cm-1等處(圖1)。其中3 437～3 402 cm-1為羥基伸縮振動吸收峰2 929～2 925cm-1為甲基反對稱伸縮振動吸收峰，2 856～2 854 cm-1為亞甲基對稱伸縮振動吸收峰，1 740～1 718 cm-1為醛類或酮類的羰基伸縮振動吸收峰，1 688～1 626 cm-1為碳雙鍵伸縮振動、羰基伸縮振動或酰胺彎曲振動吸收峰，1 516～1 513 cm-1為苯環(huán)骨架振動吸收峰，1 456～1 423 cm-1可能為甲基反對稱彎曲振動或亞甲基彎曲振動吸收峰，1 323、1 260～1 257、1 168～1 121、1 075～1 029 cm-1為C-O伸縮振動吸收峰，963以下cm-1為苯環(huán)骨架振動吸收峰。

由表1可知，產(chǎn)自貴南與軍功、湟中、幫菜四地寬葉羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)性在0.900以上，與其他地方的相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)性在0.900以下；產(chǎn)自佑寧寺的寬葉羌活與其他地方相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)性在0.900以下；產(chǎn)自瑪可河的寬葉羌活與互助北山、軍功、湟中、幫菜的相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)性在0.900以上，其他地方的相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)性在0.900以下；產(chǎn)自互助北山的寬葉羌活與瑪可河、軍功、湟中、幫菜的相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)性在0.900以上，其他地方的藥材相比化學(xué)成分差異較大；產(chǎn)自民和的寬葉羌活與瑪可河、互助北山、湟中的相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)性在0.900以上，與其他地方的相比化學(xué)成分差異較大；產(chǎn)自軍功的寬葉羌活與瑪可河、互北山、湟中、幫菜的相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)性在0.900以上，其他地方的相比化學(xué)成分差異較大；產(chǎn)自湟中與瑪可河、互北山、軍功、幫菜的寬葉羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)性在0.900以上，其他地方的相比化學(xué)成分差異較大。結(jié)果表明：產(chǎn)自佑寧寺的寬葉羌活化學(xué)成分與其他地方的相比差異較大，而產(chǎn)自貴南、民和、瑪可河、互助北山、軍功、湟中、幫菜的寬葉羌活化學(xué)成分相似。

2.2 不同產(chǎn)地寬葉羌活二階導(dǎo)數(shù)光譜的比較

由于在1 800 cm-1之前會受-OH的影響，而800 cm-1之后基線漂移過大，故選擇1 800～800 cm-1范圍內(nèi)寬葉羌活二階導(dǎo)數(shù)光譜(圖2)進(jìn)行分析。寬葉羌活二階導(dǎo)數(shù)譜中使用垂直光標(biāo)標(biāo)記，顯示1 627、1 606、1 592、1 580、1 566、1 515、1 501、1 488、1 467、1 400、1 369、1 351、1 286、1 258、1 169、1 105、1 076、984 cm-1是幾個地方寬葉羌活的共同峰。

2.3 寬葉羌活主成分分析

于1 800～800 cm-1波數(shù)處[3]，選取8個不同產(chǎn)地的寬葉羌活紅外一維圖譜1 628、1 074、1 033 cm-13個共有峰，以吸光度為指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。其KMO值為0.721，p=0.008，說明所選3個共有峰適宜做主成分分析，結(jié)果如表2，第一主成分累計(jì)方差為85.818%，說明第一個主成分即可解釋3個紅外吸收峰變異的85.818%，即第一個主成分可以利用資料量的85.818%；經(jīng)旋轉(zhuǎn)成分矩陣計(jì)算因子最終的得分后，進(jìn)一步計(jì)算各產(chǎn)地寬葉羌活化學(xué)成分累積量綜合得分，結(jié)果如表2所示，8個不同產(chǎn)地寬葉羌活化學(xué)成分累積量大小依次為果洛軍功、互助北山、民和、貴南、湟中、幫菜、佑寧寺、瑪可河。

表1 不同產(chǎn)地的寬葉羌活藥材相關(guān)性測定結(jié)果

表2 解釋的總方差

表3 成分因子得分變量

圖3 不同產(chǎn)地寬葉羌活聚類分析圖

2.4 聚類分析

將寬葉羌活一維紅外光譜經(jīng)吸光度轉(zhuǎn)換、基線校正及歸一化后，以吸光度為量化指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。

抽取寬葉樣品的主要3個共有吸收峰數(shù)據(jù)點(diǎn)，即相對應(yīng)的吸收峰A值，SPSS17.0軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3。從系統(tǒng)聚類分析圖可以看出，可以將民和、互助北山、果洛軍功、湟中、瑪可河地區(qū)的寬葉羌活歸為一類，幫菜、貴南的歸為一類。佑寧寺的為一類。

3 討論

通過構(gòu)建青海8個產(chǎn)地寬葉羌活整體紅外指紋圖譜，定性定量的分析了青海8個不同產(chǎn)地羌活品質(zhì)及相互關(guān)系。結(jié)果表明，8個產(chǎn)地的寬葉羌活樣品中有18個共有峰，通過相關(guān)性分析及主成分分析結(jié)果表明：青海8個不同產(chǎn)地寬葉羌活所含化學(xué)成分的種類及含量存在一定差異，且即便是化學(xué)成分類型相似，但化學(xué)成分累積量也存在一定差異，進(jìn)而影響其品質(zhì)的差異。中藥材由于產(chǎn)地不同，生代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)類型及有效成分含量方面均存在一定的差異性[6]，通過測定中藥材整體紅外特征指紋圖譜，在宏觀上可以反應(yīng)中藥化學(xué)成分類型及相互關(guān)系，并通過不同產(chǎn)地間中藥材一維紅外指紋圖譜及二階導(dǎo)數(shù)光譜的峰形、出峰位置及相關(guān)系數(shù)分析，對不同產(chǎn)地間藥材進(jìn)行定性分析，找出相互間的關(guān)系，且此方法指紋性強(qiáng)，分析速度快，靈敏度高。同時，在一維紅外圖譜的基礎(chǔ)上，經(jīng)吸光度轉(zhuǎn)化、基線校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以特征峰吸光度為量化指標(biāo)，選擇特征性強(qiáng)的共有特征峰進(jìn)行主成分分析和聚類分析，并計(jì)算綜合得分，評定中藥材化學(xué)成分累積量，建立不同產(chǎn)地間中藥材的化學(xué)成分累積量品質(zhì)關(guān)系評價。

但由于中藥材化學(xué)成分類型復(fù)雜，藥理活性物質(zhì)基礎(chǔ)不明，僅僅建立以化學(xué)物質(zhì)為特征的指紋圖譜，還無法滿足中藥材“譜—效”關(guān)系的質(zhì)量控制要求。