周 琦，明 強(qiáng)，劉 敏，駱春艷

（1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，武漢 430064；2.上海市第十人民醫(yī)院，上海 200072）

心血管疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康，常導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生死亡，造成功能性心肌細(xì)胞缺失，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem sells，BMSCs）是骨髓中最豐富的細(xì)胞，存在于機(jī)體結(jié)締組織和器官基質(zhì)中，具有多向分化潛能和自我更新能力［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為心肌細(xì)胞的能力，可用于修復(fù)缺血性心臟?。?］。因此，誘導(dǎo)BMSCs 向心肌細(xì)胞分化，為現(xiàn)代心血管系統(tǒng)疾病的臨床治療提供了新方向。實(shí)驗(yàn)證明5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）可有效誘導(dǎo)BMSCs 分化為心肌樣細(xì)胞［5-6］。

研究顯示，多種微小RNA（micro RNA，miR）可提高BMSCs 分化為心肌細(xì)胞的效率［7-8］。miR-19b 在多種生物的胚胎心臟中均有表達(dá)，在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在心肌細(xì)胞發(fā)育晚期具有維持細(xì)胞增殖，抑制凋亡的作用［9］。但關(guān)于miR-19b誘導(dǎo)BMSCs 分化為心肌細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道較少，本研究將重點(diǎn)探討miR-19b 的表達(dá)對(duì)BMSCs 向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡清潔級(jí)SD 雄性大鼠，10 只，100 g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.42000600029522。

1.2 主要材料與儀器

L-DMEM 購(gòu)自Hyclone 公司；胎牛血清、Opti-MEM 購(gòu)自Gibco 公司；CD44、CD34 抗體購(gòu)自eBio?science 公司；CD105 抗體購(gòu)自Abcam 公司；CD90抗體購(gòu)自BD公司；Trizol購(gòu)自Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；SYBR Green 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自KAPA Biosystems公司；噻唑藍(lán)（MTT）、三甲基亞砜（DMSO）、5-aza購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich 公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）、化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore 公司；兔抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、兔抗心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、兔抗心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）購(gòu)自Abcam 公司；miR-19b mimics/inhibitor 由銳博生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司。倒置熒光顯微鏡購(gòu)自Leica 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo 公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將SD 大鼠頸椎脫臼處死后，用75%的乙醇進(jìn)行消毒15 min。放入超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌條件下用組織剪與組織鑷來(lái)剝離大鼠雙側(cè)的股骨和脛骨，用骨鉗剪去分離后的大鼠股骨與脛骨的兩端骨骺，使用無(wú)菌注射器抽取無(wú)血清L-DMEM 反復(fù)數(shù)次沖洗髓腔，直至骨髓完全沖出為止。再用7號(hào)針頭對(duì)沖洗出的組織塊反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液。1 200 r/m離心10 min，棄上清，L-DMEM 重懸。使用200 目篩網(wǎng)對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾兩次，得到細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取10 mL 細(xì)胞濃度為1.0×107/mL 的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清和1%三抗的L-DMEM中，放入恒溫保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后換液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗兩遍，更換培養(yǎng)基，每隔3～4 d 換液一次。培養(yǎng)10 d 后，顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁率達(dá)80%至90%時(shí)，對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 取生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/m 離心5 min，棄上清液，PBS 洗滌2 次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取100 μL 單細(xì)胞懸液，按抗體名稱(chēng)標(biāo)記，第1 管加入2 μL CD44，第2管加入2 μL CD90，第3管加入2 μL CD34，第4 管加入2 μL CD105，第5 管為空白對(duì)照，4 ℃避光孵育45 min。磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，100 μL 流式專(zhuān)用Buffer 重懸細(xì)胞，再加入2 μL 二抗4 ℃避光孵育45 min。加入400 μL 流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞分組與處理 將細(xì)胞分為5 組：對(duì)照組；miR-19b mimics 組，采用miR-19b mimics 轉(zhuǎn)染BMSCs；mimics-NC 組，采用miR-19b mimics-NC 轉(zhuǎn)染BMSCs；miR-19b inhibitor 組，采用miR-19b in?hibitor 轉(zhuǎn)染BMSCs；inhibitor-NC 組，采用miR-19b inhibitor-NC 轉(zhuǎn)染BMSCs。轉(zhuǎn)染前，將5×105個(gè)細(xì)胞接種于2 mL培養(yǎng)基中，分布于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。取100 pmol mimics（或inhibitor、NC）稀釋于250 μL Opti-MEM 中，取5 μL Lipofectamine 2000 稀釋于250 μL Opti-MEM中，將兩者稀釋液混勻后，室溫孵育20 min，然后加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃，轉(zhuǎn)染48 h。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)miR-19b mimics 及inhibitor 轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組細(xì)胞，Trizol 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cD?NA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-19b 的表達(dá)。擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

表1 miR-19b 及內(nèi)參基因引物序列

1.3.5 5-氮胞苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)變化轉(zhuǎn)染48 h后，待細(xì)胞貼壁達(dá)80%時(shí)，更換含10 μmol/L 5-aza的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24 h。另設(shè)置驗(yàn)證組，用含12%胎牛血清L-DMEM代替5-aza誘導(dǎo)液。24 h后更換為含12%胎牛血清的L-DMEM，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)9 d，第0、1、3、6、9 天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ANP、cTnI 及cTnT 表達(dá) 收集第0、1、3、6、9天細(xì)胞，加入RIPA 蛋白裂解液提取總蛋白，采用二辛可酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣20 μg 蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜膜上，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5 h。磷酸鹽緩沖液洗膜后，分別加入ANP 抗體（1∶1 000）、cTnI 抗體（1∶1 000）、cTnT抗體（1∶1 000）以及GAPDH 抗體（1∶1 000）的稀釋液，于4°C 孵育過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液洗膜3 次，加入羊抗兔IgG 抗體稀釋液，室溫孵育1.5 h。磷酸鹽緩沖液洗膜3 次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值作為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)觀察

原代BMSCs 培養(yǎng)10 d 后在顯微鏡下觀察其形態(tài)，發(fā)現(xiàn)BMSCs 進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，多呈長(zhǎng)梭形，排列規(guī)則緊密，具有方向性，見(jiàn)圖1。

圖1 原代SD 大鼠BMSCs 光學(xué)顯微鏡下形態(tài)圖像（×100、×200）

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs 表面標(biāo)記物表達(dá)，結(jié)果顯示：CD34 表達(dá)率為0.96%，呈陰性；CD44 表達(dá)率為98.34%，CD90 表達(dá)率為96.99%，CD105 表達(dá)率為96.68%，均呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs 表面標(biāo)記物表達(dá)圖像

2.3 微小RNA-19b mimics/inhibitor 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果

采用2-ΔΔCT法計(jì)算細(xì)胞miR-19b 相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組（1.00±0.04）比較，mimics-NC 組（0.97±0.06）和inhibitor-NC 組（1.05±0.06）細(xì)胞中miR-19b 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與NC 組比較，miR-19b mimics 組細(xì)胞中miR-19b 表達(dá)水平（3.90±0.14）明顯升高，miR-19b inhibitor 組miR-19b 表達(dá)水平（0.37±0.04）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 qRT-PCR 檢測(cè)各組BMSCs 中miR-19b 表達(dá)水平

2.4 微小RNA-19b對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響

觀察第0、1、3、6、9 天的BMSCs 分化情況，前3 天兩組細(xì)胞形態(tài)變化不大，第6 天和第9 天觀察，5-aza 誘導(dǎo)組BMSCs 出現(xiàn)聚集，呈渦旋狀，而miR-19b mimics 組細(xì)胞形態(tài)變化不大，見(jiàn)圖4，表明miR-19b 不具有誘導(dǎo)BMSCs 細(xì)胞分化的作用。

圖4 miR-19b 及5-aza 誘導(dǎo)BMSCs 形態(tài)學(xué)光學(xué)顯微鏡下圖像（×100）

2.5 微小RNA-19b 協(xié)同5-zara 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化

觀察各組BMSCs 形態(tài)變化，前3 天各組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，第6 天和第9 天觀察，對(duì)照組和NC 組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞體積變大，部分細(xì)胞聚集呈渦旋樣，miR-19b mimics 組變化更明顯，而miR-19b 組細(xì)胞在第9 天才開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)變化，見(jiàn)圖5。

圖5 各組BMSCs 不同時(shí)間點(diǎn)光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)圖像（×100）

2.6 微小RNA-19b 協(xié)同5-zara 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ANP、cTnI 及cTnT 表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞在第0、1、3、6、9 天時(shí)ANP、cTnI 及cTnT 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-19b mimics 組ANP、cTnI 及cTnT蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05），而miR-19b inhibi?tor 組ANP、cTnI 及cTnT 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中ANP、cTnI 及cTnT 表達(dá)增多，見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot 檢測(cè)BMSCs 中ANP、cTnI 及cTnT 的表達(dá)（1：Control；2：mimics-NC；3：inhibitor-NC；4：miR-19b mimics；5：miR-19 inhibitor）

3 討論

BMSCs 是來(lái)自骨髓，具有定向分化為心肌細(xì)胞潛能的干細(xì)胞，BMSCs 的移植可有效減緩心肌梗死癥狀，改善心功能，在心血管疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景［10］。但目前BMSCs 移植的臨床治療效果并不理想，主要是由于BMSCs 分化為心肌細(xì)胞的效率不高，導(dǎo)致對(duì)壞死心肌的修復(fù)能力有限［11］。因此，提高BMSCs 分化成心肌細(xì)胞的效率成為BMSCs 移植用于臨床亟待解決的問(wèn)題。為了提高BMSCs 的治療效果，研究人員已開(kāi)始利用基因工程、細(xì)胞表面修飾等技術(shù)使BMSCs 具有靶向傳遞功能，過(guò)度表達(dá)相關(guān)蛋白來(lái)增強(qiáng)BMSCs的療效［12］。

MiR 是一類(lèi)單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度通常為18～25 個(gè)核苷酸，通過(guò)與特定mRNA 靶標(biāo)的3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合后以轉(zhuǎn)錄后方式負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)［13］。MiR 在提高BMSCs 分化效率上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，而miR-19b 表達(dá)水平與心肌細(xì)胞分化有著密切聯(lián)系［9，14］，為了探究miR-19b 與BMSCs 分化心肌樣細(xì)胞之間的關(guān)系，本文對(duì)此進(jìn)行了體外研究。5-aza 是實(shí)驗(yàn)研究中被廣泛用于定向誘導(dǎo)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑，但由于其對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物本身具有較高的毒性作用，因此在選擇較安全濃度的同時(shí)提高誘導(dǎo)分化率成為其將來(lái)應(yīng)用于臨床的主要策略?；谙嚓P(guān)報(bào)道［15］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用10 μmol/L 5-aza 對(duì)BMSCs 進(jìn)行心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)，結(jié)果顯示：miR-19b 并不具備誘導(dǎo)BMSCs 細(xì)胞分化的能力，但可促進(jìn)5-aza對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用。

ANP 是一種有效的利尿藥和血管擴(kuò)張肽、主要由心肌細(xì)胞分泌的激素，在慢性心力衰竭中發(fā)揮重要作用［16］。在胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過(guò)程中，隨著誘導(dǎo)分化的時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞中ANP基因及蛋白表達(dá)均顯著升高［17］。心肌肌鈣蛋白（cTn）是心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，包括cTnT、cTnI 和cTnC，其中cTnI 和cTnT 是心肌細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu)蛋白［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，在5-aza 誘導(dǎo)下，miR-19b mimics 組BMSCs 中ANP、cTnI 及cTnT 蛋白表達(dá)均高于其他組，結(jié)合各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，說(shuō)明miR-19b mimics 組BMSCs 向心肌樣細(xì)胞分化的水平更高。

綜上所述，miR-19b 不具備誘導(dǎo)BMSCs 向心肌樣細(xì)胞分化的能力，但其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)5-aza對(duì)BMSCs 定向分化的誘導(dǎo)作用，即miR-19b 協(xié)調(diào)5-aza 可提高BMSCs 進(jìn)行心肌樣細(xì)胞分化的分化效率。