劉亞東，馮莉莉，王海晶，齊 茗，馬利軍，屈曉威，王麗萍

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院，延安 716000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart dis?ease，CHD）患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。早期診斷與對(duì)癥治療可降低AMI患者的病死率［1］。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprorein-associated phosphohpase A2，Lp-PLA2）是一種新型的炎癥標(biāo)志物，有學(xué)者認(rèn)為Lp-PLA2 具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［2-3］。更多的研究則認(rèn)為Lp-PLA2 是一種血管特異性炎癥標(biāo)志物，與動(dòng)脈粥樣斑塊形成密切相關(guān)［4-6］。遺傳學(xué)研究表明Lp-PLA2 活性62%受基因影響［7］，而基因的突變則增加了心血管事件的發(fā)生［8］，包括R94H、V297F、A379V 等基因位點(diǎn)。本研究通過研究健康人群及CHD 患者Lp-PLA2 基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），探討遺傳因素與AMI 發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2018 年1 月至2020 年7 月延安大學(xué)附屬醫(yī)院確診的CHD 患者320 例，根據(jù)是否合并AMI分為CHD組［n=200，年齡（63±11.2）歲，男性142例，女性58 例］和AMI 組［n=120，年齡（66±11.6）歲，男性81 例，女性39 例］。所有患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影（CAG）診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2012 年CHD 的診斷及分類診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并陳舊性心肌梗死、心肌病、風(fēng)濕性心臟病、主動(dòng)脈夾層等心臟病患者；（2）合并自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝及腎功能不全、急和慢性感染、腫瘤等的患者；（3）互有血緣關(guān)系的患者；（4）精神障礙患者。選取同期在本院進(jìn)行體檢的表觀健康體檢者為健康對(duì)照（healthy control，HC）組［n=200，年齡（49±9.4）歲，男性121 例，女性79 例］。本項(xiàng)研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及受試者家屬知情同意。

1.2 儀器與試劑

使用西門子XPT 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（total cho?lesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、Lp-PLA2、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）濃度。TC、TG、HDL-C、LDL-C 使用西門子原裝試劑及校準(zhǔn)品、質(zhì)控品。Lp-PLA2使用德賽試劑及配套質(zhì)控品、校準(zhǔn)品，Hcy 使用寧波美康試劑及質(zhì)控品、校準(zhǔn)品。高敏C-反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）使用深圳國賽試劑及校準(zhǔn)品、質(zhì)控品。以上項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評(píng)結(jié)果均在控；使用美國Invitrogen 公司提供的DNA 提取試劑盒和Taq DNA 聚合酶、定制引物。R92H 引物序列包括上游引物5′-CAATCACCACAGGCAGCCTAA-3′，下游引物5′-TCCCATCCAACTCAGAATGG-3′。V297F 引物序列包括上游引物5′-TCCAGTGTGG?GTGACTACAAA-3′，下游引物5′-TATGGGGGCA?AAAGAATAGC-3′。A379V引物序列包括上游引物5′-TCAAGATACCAAGCAAGAACAAGA-3′，下游引物5′-GGATGTAAAGCAGCAAAATTGA-3′。使 用3730XL 型DNA 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3 資料收集

通過病例查閱的方式收集所有納入者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、原發(fā)性高血壓（高血壓）、糖尿病及氯吡格雷、阿司匹林、他汀類藥物、β-受體阻斷藥、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）等藥物使用情況。

1.4 標(biāo)本采集

所有受試者均采集清晨空腹靜脈血各5 mL，一份使用促凝管采集，用于生化指標(biāo)檢測(cè)。一份使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集，離心取上清，-80 ℃保存，用于DNA 提取。

1.5 外周血DNA 提取

嚴(yán)格按照Invitrogen 公司DNA 提取試劑盒，使用DNA 提取試劑盒的說明書提取患者DNA，將提取到的DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)定DNA濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用（）表示，多組間比較使用方差分析，兩兩之間比較使用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)表示（四分位數(shù)間距）［M（P25～P75）］，多組之間比較使用Welch 近似方差分析，多重比較使用Dunnet′s T3檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用［n（%）］表示，使用卡方（χ2）檢驗(yàn)。使用Logistic 回歸分析，并用優(yōu)勢(shì)比（OR）及95%置信區(qū)間（CI）表示，OR>1 表示該因素為危險(xiǎn)因素，OR<1表示該因素為保護(hù)因素。P<0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)單樣本Kolmogorov-Smirnov正態(tài)檢驗(yàn)，年齡、TC、TG、HDL-C、LDL-C 呈正態(tài)分布（使用單因素方差分析），Lp-PLA2、HCY、及hS-CRP 呈非正態(tài)分布（使用Welch 近似方差分析）。

2 結(jié)果

2.1 3 組受試者基線資料比較

CHD 組與HC 組受試者年齡、性別、飲酒史及血清Lp-PLA2、Hcy、hs-CRP 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），其余項(xiàng)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；AMI 組與HC 組受試者年齡、吸煙史、飲酒史及血清Lp-PLA2、Hcy、hs-CRP 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；AMI 組與CHD 組患者高血壓及血清Lp-PLA2、Hcy、hs-CRP濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；詳見表1。

表1 HC 組、CHD 組和AMI 組受試者的基線資料比較 ［，M（P25～P75），n（%）］

表1 HC 組、CHD 組和AMI 組受試者的基線資料比較 ［，M（P25～P75），n（%）］

注：與HC 組比較，aP<0.05；與CHD 組比較，bP<0.05；c為Welch 近似方差分析；d為χ2檢驗(yàn)。t1為CHD 組與HC 組比較的t 值；t2為AMI 組與CHD 組比較的t 值

2.2 脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 與急性心肌梗死的相關(guān)性分析結(jié)果

以表1 中CHD 組與AMI 組比較P<0.05 的 變 量為自變量（賦值：是=1，否=0），以是否發(fā)生心肌梗死為因變量進(jìn)行Logistic 回歸分析（見表2），結(jié)果顯示，高血壓、Lp-PLA2、Hcy及hs-CRP均是AMI的危險(xiǎn)因素（均P<0.05）。對(duì)高血壓、Hcy、hs-CRP 等因素進(jìn)行校準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)，Lp-PLA2 仍是AMI 的危險(xiǎn)因素（OR=4.297，95%CI：3.571～6.983，P=0.000）。

表2 AMI 的危險(xiǎn)因素Logistic 回歸分析結(jié)果

2.3 脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 基因型基因分布

R92H、V279F和A379V三種基因在HC組、CHD組和AMI 組受試者的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。3 組受試者的V279F 和A379V 基因頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3 組受試者的R92H 基因頻率和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HC 組與CHD 組受試者基因型RH+HH 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.624，P=0.202）；AMI 組與HC 組、CHD組受試者基因型RH+HH 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.909，P=0.000；χ2=12.613，P=0.000）；HC 組與CHD組受試者等位基因H比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.957，P=0.162）；AMI 組與HC 組、CHD 組受試者等位基因H比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.906，P=0.000；χ2=8.837，P=0.003）。

表3 3 組受試者3 種基因型的基因分布比較 ［n（%）］

2.4 脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 基因多態(tài)性與急性心肌梗死的相關(guān)性

以AMI作為自變量，SHP R92H為因變量。調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險(xiǎn)因素后發(fā)現(xiàn)，RH+HH 基因型和H 等位基因使AMI 風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=2.651，95%CI：1.498～4.597，P=0.001；OR=2.055，95%CI：1.618～4.207，P=0.001）；而V279F、A379V仍與CHD（OR=0.975，95%CI：0.326～3.201，P=0.814；OR=0.922，95%CI：0.415～4.118，P=0.647）和AMI（OR=0.899，95%CI：0.283～6.057，P=0.661；OR=0.911，95%CI：0.215～7.107，P=0.572）風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。

2.5 分層分析

以年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等亞組對(duì)R92H 和AMI 風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行分層分析，結(jié)果（表4）顯示，男性患者及65 歲以上的CHD患者有更高的AMI 風(fēng)險(xiǎn)（OR=3.201，95%CI：1.507～6.992，P=0.006；OR=3.097，95%CI：1.191～7.911，P=0.007）。與吸煙者（OR=1.682，95%CI：1.228～3.696，P=0.213）相比較，不吸煙者（OR=2.177，95%CI：1.481～4.913，P=0.001）的風(fēng)險(xiǎn)更大。高血壓和高脂血癥使AMI 的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=3.391，95%CI：1.337～6.096，P=0.001；OR=3.661，95%CI：0.993～8.207，P=0.003）。

表4 分層分析結(jié)果

3 討論

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，血清Lp-PLA2 濃度可用于輔助診斷CHD、與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度及病變支數(shù)相關(guān)、與冠狀動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性相關(guān)、可用于輔助診斷早期急性冠狀動(dòng)脈綜合征等［10-13］。遺傳學(xué)研究顯示，基因會(huì)影響Lp-PLA2 活性，其中PLA2G7 多個(gè)位點(diǎn)基因突變會(huì)影響Lp-PLA2 活性，進(jìn)而影響CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究通過對(duì)HC 組、CHD 組、AMI 組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，3 組受試者的V279F、A379V 基因型和等位基因比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在校正了年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等因素后仍未發(fā)現(xiàn)V279F、A379V與CHD（P=0.814，0.647）和AMI（P=0.661，0.572）風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。HC 組、CHD 組、AMI 組的R92H 基因型（RH+HH）和等位基因（H）兩兩比較發(fā)現(xiàn)，HC 組與CHD 組的基因型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.202，0.162），而AMI組與HC 組、CHD 組基因型（RH+HH）和等位基因（H）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.005）。調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險(xiǎn)因素后發(fā)現(xiàn)，R92H（RH+HH）和等位基因（H）使CHD 患者AMI 風(fēng)險(xiǎn)增加（均P=0.001）。Iong 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，中國漢族人群V279F 位點(diǎn)突變可增加冠狀動(dòng)脈病變風(fēng)險(xiǎn)。HIFMECH 研究顯示，高加索人群A379V 的變異似乎有降低歐洲人群心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)，顯示了A379V 對(duì)CHD 的發(fā)展起保護(hù)作用［15］。2008 年杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心對(duì)Lp-PLA2 基因做了較全面的分析，發(fā)現(xiàn)A379V和R92H等位基因在CHD 組分布顯著升高，調(diào)整了傳統(tǒng)的CHD 風(fēng)險(xiǎn)后，這兩個(gè)SNP 仍表現(xiàn)出獨(dú)立相關(guān)性；進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)A379V 與更嚴(yán)重的CHD 相關(guān)［16］。對(duì)R92H 等位基因與AMI 風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行危險(xiǎn)分層，結(jié)果顯示男性患者及65 歲以上的CHD 患者、高血壓及高脂血癥帶來更高的AMI 風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)于吸煙者，不吸煙者的風(fēng)險(xiǎn)更高。而是否患有糖尿病對(duì)AMI 的風(fēng)險(xiǎn)無差異。本研究的結(jié)果與上述結(jié)果［14-16］均不相同，可能與研究對(duì)象的種族差異、研究方法的設(shè)計(jì)、樣本量等選擇有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果顯示CHD 患者Lp-PLA2 基因R92H 位點(diǎn)SNP 與AMI 的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但對(duì)于該實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，還需要更深入地探討Lp-PLA2 的臨床切入點(diǎn)。