范文潔 陳象遜 周夢(mèng)熙 羅薇薇 楊 林

胃癌是全球第5位常見(jiàn)腫瘤，也是造成癌癥死亡的第2位病因。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居第2位，每年新增病例多達(dá)40萬(wàn)，已經(jīng)成為威脅民眾健康的重大疾病之一。由于起病隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于疾病晚期，治療效果多不理想。研究表明晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者的中位生存期不足1年。由此可見(jiàn)，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找潛在的防治靶標(biāo)具有重要的理論與實(shí)際意義。類RAS激活物2(RAS protein activator like 2,RASAL2)是一種Ras-GTP酶活化蛋白(RasGTPase-activating protein,RasGAP)，隸屬于SynGAP家族，于1998年首次在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，基因定位于人類1號(hào)染色體長(zhǎng)臂1q24-25。RASAL2參與了胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而，RASAL2是否參與胃癌發(fā)病以及影響胃癌患者預(yù)后尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究基于生物信息學(xué)，利用Oncomine、GEPIA、cBioPortal等腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析RASAL2基因在胃癌中的表達(dá)、變異及其與預(yù)后的關(guān)系，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RASAL2在胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用，以期為后續(xù)研究提供線索，也為胃癌的防治提供潛在分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株MGC-803購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自APExBIO公司。LipofectamineRNAiMAX購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。RASAL2-siRNA購(gòu)自上海拓然生物科技有限公司，序列為：正義鏈5’-GCAAGAUCAUCAACUCUUAdTdT-3’，反義鏈5’-UAAGAGUUGAUGAUCUUGCdTdT-3’，按說(shuō)明書(shū)以50 μL RNAase-free HO/nmolsiRNA溶解為20 μM儲(chǔ)存液，置于-20 ℃凍存待用。RASAL2抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，GAPDH抗體購(gòu)自Servicebio公司。Transwell小室(24孔)、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自SIGMA公司。

1.2 生物信息學(xué)分析 使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索RASAL2在不同組織腫瘤中的基因表達(dá)情況。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證RASAL2在胃癌中的表達(dá)。通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析，以四分位數(shù)，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并按照性別、分化程度及分期進(jìn)行總生存率及亞組生存分析。通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析RASAL2在胃癌患者中的變異情況及其與生存預(yù)后間的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MGC-803細(xì)胞以5×10個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞融合至60%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組與RASAL2沉默組，分別使用與所有基因均無(wú)同源性序列的non-target siRNA或RASAL2-siRNA轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞。以250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基OptiMEM稀釋5 μL siRNA，250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基OptiMEM稀釋5 μL Lipofectamine RNA iMAX，混勻室溫孵育5 min；將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA稀釋液混合，室溫靜置20 min；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物按每孔50 μL加入至96孔板中，以無(wú)血清培養(yǎng)基RPMI 1640將每孔終體積補(bǔ)至100 μL；轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：24 、48 及72小時(shí)，于各時(shí)間點(diǎn)前2 h加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取1×10個(gè)胃癌MGC-803細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，用滅菌的10 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部劃線，無(wú)血清培養(yǎng)基洗去懸浮細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在0、24 小時(shí)置于倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件測(cè)量各組劃痕面積，細(xì)胞遷移能力以損傷修復(fù)百分比表示。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室上室，37 ℃孵育1 h。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組胃癌MGC-803細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸至5×10/mL，接種細(xì)胞于Transwell上室，將含10%胎牛血清培養(yǎng)基加入Transwell下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室。擦除小室表面細(xì)胞及基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，取細(xì)胞數(shù)平均值評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。

1.7 Western blot 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，以RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按每孔20 μg上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(RASAL2 1∶500，GAPDH 1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

2 結(jié)果

2.1 RASAL2在胃癌組織中表達(dá)增加 通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到RASAL2相關(guān)的腫瘤研究332項(xiàng)、涉及樣本數(shù)31 947，符合“

P

<0.001；FOLD CHANGE:2；Gene rank: 10%”條件的研究共24項(xiàng)，其中表達(dá)增高14項(xiàng)、表達(dá)降低10項(xiàng)，見(jiàn)圖1A。在胃癌相關(guān)研究中，檢索到的3項(xiàng)研究均表明RASAL2在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，增高倍數(shù)分別為2.638、2.699和3.269，見(jiàn)表1。進(jìn)一步在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在涉及408例胃癌患者與211例對(duì)照患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)中，RASAL2在胃癌組織中的基因表達(dá)水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)圖1B。

表1 RASAL2在不同胃癌研究中的基因表達(dá)差異

圖1 RASAL2在胃癌等常見(jiàn)腫瘤中的表達(dá)情況

2.2 RASAL2基因表達(dá)與胃癌患者預(yù)后分析 RASAL2高表達(dá)組總體生存率低于低表達(dá)組[風(fēng)險(xiǎn)比(

HR

)=2.28， 95%CI：1.77～2.94，

P

<0.05]，見(jiàn)圖2A。進(jìn)一步按性別、腫瘤分化程度及分期進(jìn)行亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男性與女性胃癌患者中，RASAL2高表達(dá)組總體生存率均低于低表達(dá)組(男性：

HR

=2.4，

P

<0.05；女性：

HR

=2.73，

P

<0.05)，見(jiàn)圖2B；按分化程度進(jìn)行分層，RASAL2高表達(dá)組與低表達(dá)組在高分化和低分化胃癌患者中的總體生存率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，但在中分化胃癌患者中，與RASAL2低表達(dá)組相比，高表達(dá)組總體生存率更低(

HR

=4.74，

P

<0.05)，見(jiàn)圖2C；按分期進(jìn)行分層，RASAL2高表達(dá)組在Ⅰ期和Ⅲ期胃癌患者中的總體生存率均低于RASAL2低表達(dá)組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，其中在Ⅰ期胃癌患者中，RASAL2高表達(dá)組相對(duì)于低表達(dá)組的風(fēng)險(xiǎn)比

HR

高達(dá)6.22(

P

<0.05)，但RASAL2高表達(dá)與低表達(dá)組在Ⅱ期和Ⅳ期胃癌患者中的總體生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見(jiàn)圖2D。

圖2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中RASAL2表達(dá)與

2.3 RASAL2在胃癌中的基因變異情況及其與預(yù)后的關(guān)系 在1 365例胃癌患者中，具有完整的基因突變和拷貝數(shù)變異資料的胃癌樣本共計(jì)1 120例，其中78例(變異組)發(fā)生基因變異，其余為非變異組，總變異率為7%，以錯(cuò)義突變最為常見(jiàn)(28.79%)，見(jiàn)圖3A。進(jìn)一步對(duì)RASAL2基因變異與生存預(yù)后進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變異組與非變異組患者的總體生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，但變異組患者無(wú)病生存率更高(

P

<0.05)。見(jiàn)圖3B。

圖3 胃癌患者中RASAL2基因變異情況

2.4 沉默RASAL2對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RASAL2蛋白表達(dá)顯著降低(

P

<0.05)。進(jìn)一步通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明沉默RASAL2后，細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組顯著下降(

P

<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染后RASAL2蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力的變化

2.5 沉默RASAL2對(duì)MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲的影響 沉默RASAL2能顯著降低MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組細(xì)胞24 h損傷修復(fù)面積為(79.57±5.40)%，而RASAL2沉默組為(46.50±2.49)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=9.632，

P

=0.001)。而在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組與RASAL2沉默組平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(188.67±13.58)和(101.33±9.45)，抑制率為53.71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=9.144，

P

=0.001)。見(jiàn)圖4。

圖4 MGC-803細(xì)胞細(xì)胞劃痕與Transwell實(shí)驗(yàn)

3 討論

RASAL2是RasGAP基因家族中的一員，廣泛表達(dá)于人體各組織器官，其編碼產(chǎn)物為一種Ras-GTP酶激活蛋白，可催化Ras-GTP水解為Ras-GDP，從而發(fā)揮對(duì)Ras蛋白活性的負(fù)性調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，RASAL2可以通過(guò)ERK通路、YAP通路以及調(diào)控外泌體分泌參與胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并且其表達(dá)水平與肺癌、肝癌及腎癌患者的生存預(yù)后顯著相關(guān)，但RASAL2在胃癌患者中的表達(dá)及其臨床價(jià)值尚無(wú)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，RASAL2在胃癌患者中的基因表達(dá)水平明顯增高，并且其表達(dá)水平與胃癌患者生存預(yù)后顯著相關(guān)。在不同分期胃癌患者中，雖然Ⅱ期和Ⅳ期胃癌患者中RASAL2高表達(dá)與低表達(dá)組的總體生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但總體來(lái)看RASAL2對(duì)分期越早的胃癌患者的生存預(yù)測(cè)作用越顯著[

HR

：6.22(Ⅰ期)>1.91(Ⅱ期)>1.6(Ⅲ期)>1.12(Ⅳ期)]。表明RASAL2不僅是胃癌患者的生存預(yù)測(cè)因子，也很可能與胃癌患者的腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。

基因變異包括基因序列變異和基因表達(dá)變異，常見(jiàn)變異類型包括錯(cuò)義突變、移碼突變、插入、缺失等，由此導(dǎo)致基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RASAL2在胃癌患者中的總體變異率為7%，其中錯(cuò)義突變最為常見(jiàn)(28.79%)，且RASAL2基因變異組的無(wú)病生存率高于非變異組，提示RASAL2基因很可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

無(wú)限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)行為，本研究進(jìn)一步在胃癌細(xì)胞株MGC-803中對(duì)RASAL2的功能進(jìn)行研究。結(jié)果表明沉默RASAL2后胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖速度減慢，并且其遷移和侵襲能力下降，因此，從體外水平驗(yàn)證了RASAL2在胃癌中的作用及其生物學(xué)功能。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的信息挖掘與綜合分析揭示了RASAL2基因在胃癌中的表達(dá)、變異及其與生存預(yù)后的關(guān)系，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RASAL2在胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用，為后續(xù)研究提供了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。鑒于本研究?jī)H使用了1種胃癌細(xì)胞株(MGC-803)且所用胃癌患者數(shù)據(jù)基于轉(zhuǎn)錄水平，得到的結(jié)論能否推廣到其他胃癌細(xì)胞株或胃癌組織尚有待于后續(xù)研究探討。此外，本研究?jī)H初步探討了RASAL2在胃癌中的作用，其具體分子機(jī)制亦有待于后續(xù)研究進(jìn)一步明確。