趙玉霞，陳鶯倩

迷迭香酸通過(guò)AMPK/mTOR通路減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷研究

趙玉霞，陳鶯倩

駐馬店市中心醫(yī)院 兒童康復(fù)科，河南 駐馬店 463000

探討迷迭香酸對(duì)新生大鼠缺血缺氧腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的影響，及其對(duì)單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的調(diào)控作用，初步探討其腦保護(hù)機(jī)制。取7 d齡SD新生大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、迷迭香酸（300 mg/kg）組、AMPK/mTOR激動(dòng)劑MT6378（10 mg/kg）組、AMPK抑制劑GSK-690693（30 mg/kg）組和迷迭香酸（300 mg/kg）＋MT6378（10 mg/kg）組，每組20只。建立HIE模型，給予相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，采用TTC染色法檢測(cè)大鼠腦梗死情況；透射電鏡（TEM）觀察大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及自噬狀況；免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）陽(yáng)性表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率；免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元磷酸化AMPK（p-AMPK）陽(yáng)性表達(dá)；Western blotting檢測(cè)大鼠海馬組織活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、mTOR及其磷酸化蛋白（p-mTOR）、Unc-51樣自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1，Ulk1）及其磷酸化蛋白（p-Ulk1）、LC3B表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦梗死嚴(yán)重，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及自噬空泡形成較多，細(xì)胞自噬及凋亡水平升高，AMPK/mTOR通路活化（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠腦梗死、海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷、凋亡及自噬減弱，AMPK/mTOR通路被抑制（＜0.05）；MT6378組海馬組織AMPK/mTOR通路進(jìn)一步激活，大鼠腦梗死、海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷、凋亡及自噬進(jìn)一步加重（＜0.05）；MT6378可逆轉(zhuǎn)迷迭香酸的上述作用（＜0.05）。迷迭香酸可能通過(guò)抑制AMPK/mTOR通路激活，降低海馬神經(jīng)元自噬及凋亡進(jìn)程，發(fā)揮抗HIE腦損傷作用。

迷迭香酸；缺血缺氧性腦損傷；AMPK/mTOR通路；新生大鼠；自噬；凋亡

新生兒缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）為圍產(chǎn)期因窒息缺氧而引起腦神經(jīng)損傷性疾病[1]。HIE具有較高的致死率及致殘率，嚴(yán)重影響新生兒的生命健康[2]。尋找安全有效的藥物及治療方法，來(lái)保護(hù)HIE并促進(jìn)HIE神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)，一直是臨床研究的重點(diǎn)任務(wù)之一。迷迭香酸為酚酸類物質(zhì)，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等多種植物中，為薄荷、丹參、迷迭香、紫蘇葉等多種藥材中的有效活性成分[3]。研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸能通過(guò)抗氧化、抗炎、抗凋亡途徑，緩解腦缺血再灌注損傷[4]。但迷迭香酸是否也能在HIE疾病過(guò)程中發(fā)揮腦保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。自噬在缺血缺氧性神經(jīng)元損傷、凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)活化等生理活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并越來(lái)越受到HIE研究的重視[5]。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）可抑制下游調(diào)控因子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白激活，抑制Unc-51樣自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1，Ulk1）磷酸化，來(lái)誘導(dǎo)自噬復(fù)合體的形成，并參與自噬調(diào)控過(guò)程[6]，且已有研究證實(shí)，AMPK在HIE大鼠腦組織中處于持續(xù)激活狀態(tài)[7-8]，提示AMPK/mTOR通路可能在HIE神經(jīng)元凋亡及自噬過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究建立HIE大鼠模型，考察迷迭香酸是否能通過(guò)AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬途徑來(lái)緩解HIE腦損傷，以期為迷迭香酸的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠120只，7 d齡，體質(zhì)量10～12 g，購(gòu)自福州海王福藥制藥有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（閩）2020-0001。動(dòng)物于駐馬店市中心醫(yī)院動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)駐馬店市中心醫(yī)院動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)IACUC-101093），符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)20190312003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司；AMPK抑制劑GSK-690693（批號(hào)20190419001）、AMPK/mTOR激動(dòng)劑MT6378（批號(hào)20190329002）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色試劑盒（批號(hào)20190321001）購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司；TUNEL染色試劑盒（批號(hào)20190227004）購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；DAPI染色試劑盒（批號(hào)20190225006）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein1light chain3，LC3B）抗體、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體、活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）抗體、mTOR抗體、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體、β-actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)分別為20190124001、20190222001、20190303002、20190403002、20190208004、20190302001、20190314005、20190204008）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Ulk1抗體（批號(hào)20190223002）購(gòu)自武漢博歐特生物科技有限公司；磷酸化Ulk1（p-Ulk1）抗體（批號(hào)20190131001）購(gòu)自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 儀器

Q250型透射電鏡（TEM，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；LF200型熒光顯微鏡（廣州萊特光電技術(shù)有限公司）；JS-1070P型化學(xué)發(fā)光成像儀（上海向帆儀器有限公司）；Hettich MIKRO220型離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；PowerPac HV Power Supply高電壓電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 大鼠HIE模型的建立、分組與給藥

新生SD大鼠麻醉，手術(shù)暴露左側(cè)頸主動(dòng)脈并結(jié)扎縫合傷口后，放回原飼養(yǎng)環(huán)境，恢復(fù)3 h，置于常壓缺氧艙內(nèi)（溫度37 ℃、濕度45%～55%、8%氧氣-92%氮?dú)猓┤毖跆幚?.5 h，若大鼠出現(xiàn)左旋即為造模成功[9]，共造模成功100只，隨機(jī)分為模型組、迷迭香酸（300 mg/kg）[10]組、AMPK/mTOR激動(dòng)劑MT6378（10 mg/kg）組、AMPK抑制劑GSK-690693（30 mg/kg）[11-12]組和迷迭香酸（300 mg/kg）＋MT6378（10 mg/kg）組，每組20只；另取20只大鼠，相同方法暴露左側(cè)頸主動(dòng)脈，但不結(jié)扎，常規(guī)飼養(yǎng)后作為對(duì)照組。于造模成功后，各給藥組ig迷迭香酸（10 mL/kg），尾iv MT6378或GSK-690693（10 mL/kg）；對(duì)照組及模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)3d。

2.2 TTC法檢測(cè)大鼠腦梗死面積

給藥結(jié)束后，各組隨機(jī)取6只大鼠，斷頭處死，取左腦，用切片機(jī)由前往后切成厚度為5 μm的組織切片。取切片，于2% TTC溶液中室溫孵育35 min，PBS溶液洗滌、10%中性甲醛固定后，用數(shù)碼相機(jī)采集圖片，梗死部分為白色，正常為紅色，用Image J軟件分析并計(jì)算梗死面積百分比。

梗死面積百分比＝梗死部分面積/總面積

2.3 TEM觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

給藥結(jié)束后，各組隨機(jī)取6只大鼠，斷頭取左腦，于冰上用解剖鏡迅速剝離取完整海馬組織，剪下組織塊（0.3 cm×0.3 cm），于2.5%戊二醛及1%鋨酸溶液中固定后，送于電鏡室鏡檢。剩余組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)透明、浸蠟、包埋后切成5 μm切片，備用。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元自噬標(biāo)記物表達(dá)情況

取“2.3”項(xiàng)下海馬組織石蠟切片，脫蠟、水化、曲拉通透化后，加入LC3B抗體（1∶400），4 ℃孵育過(guò)夜；避光加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶200），DAPI染核、甘油封片后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Pro Plus 5.0軟件分析。

2.5 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡

取“2.3”項(xiàng)下海馬組織石蠟切片，按TUNEL染色液說(shuō)明書方法染色、封片后，于顯微鏡下觀察并拍照，凋亡細(xì)胞被染成棕黃色，用Image-pro plus軟件檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)

2.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬組織p-AMPK表達(dá)

取“2.3”項(xiàng)下海馬組織石蠟切片，復(fù)溫、透化及抗原修復(fù)后，加入p-AMPK抗體（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶500），室溫孵育1 h，DAB顯色、蘇木精復(fù)染封片后，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image Pro Plus 5.0軟件分析。

2.7 Western blotting法檢測(cè)海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達(dá)

取剩余大鼠，斷頭處死，于冰上解剖取左半球海馬組織，加入裂解液，于冰上勻漿后提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1抗體（1∶800）以及β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶1000），室溫孵育2.5 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色，采用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光條帶并拍照，Image J軟件分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠腦梗死面積的影響

如圖1和表1所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加（＜0.05）；與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠腦梗死面積顯著減少（＜0.05），MT6378組腦梗死面積進(jìn)一步增加（＜0.05）；與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組腦梗死面積顯著增加（＜0.05），GSK-690693組腦梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠腦梗死面積的影響

表1 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠腦梗死面積的影響(, n =6)

與對(duì)照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05；與迷迭香酸組比較：▲＜0.05，下表同

#< 0.05control group;*< 0.05model group;▲< 0.05rosmarinic acid group, same as below tables

3.2 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及自噬標(biāo)記物表達(dá)的影響

LC3B是自噬形成的標(biāo)記物，其表達(dá)高低可反映自噬通量的強(qiáng)弱。如圖2和表2所示，對(duì)照組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，線粒體、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰，有少量溶酶體形成；LC3B在海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中弱陽(yáng)性表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組及迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)及胞核固縮，線粒體腫脹，高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)模糊甚至消失，泡狀自噬體及自噬溶酶體形成較多，部分自噬泡中包裹有未消化的細(xì)胞質(zhì)，海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中LC3B陽(yáng)性染色，LC3B陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠海馬神經(jīng)元核固縮減少，線粒體腫脹緩解，自噬空泡及自噬溶酶體形成減少，LC3B陽(yáng)性表達(dá)顯著減少（＜0.05）；MT6378組可見(jiàn)自噬空泡及自噬融酶體形成進(jìn)一步增加，LC3B陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步升高（＜0.05）。

白色箭頭：自噬小體；黑色箭頭：自噬溶酶體

表2 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元LC3B陽(yáng)性表達(dá)的影響(, n = 6)

3.3 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

如圖3和表3所示，對(duì)照組海馬神經(jīng)元少量細(xì)胞呈棕黃色，與對(duì)照組相比，模型組大鼠細(xì)胞染色加深，細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.05）；MT6378組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高（＜0.05）。與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高（＜0.05），GSK-690693組海馬神經(jīng)元凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元p-AMPK表達(dá)的影響

如圖4和表4所示，p-AMPK在對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中p-AMPK陽(yáng)性表達(dá)升高（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠海馬神經(jīng)元p-AMPK陽(yáng)性表達(dá)降低（＜0.05）。與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬神經(jīng)元p-AMPK陽(yáng)性表達(dá)升高（＜0.05），GSK-690693組p-AMPK陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 (×200)

表3 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率的影響(, n = 6)

3.5 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達(dá)的影響

如圖5和表5所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B-II/I蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。與模型組相比，迷迭香酸組及GSK-690693組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B-II/I蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。與迷迭香酸組相比，迷迭香酸＋MT6378組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B-II/I蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），GSK-69063組上述蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元p-AMPK表達(dá)的影響(×200)

表4 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬神經(jīng)元p-AMPK表達(dá)的影響(, n = 6)

4 討論

據(jù)流行病學(xué)分析，發(fā)展中國(guó)家每1000個(gè)新生兒中，有8～26個(gè)罹患HIE[2]。HIE是新生兒危害最大的常見(jiàn)疾病之一，目前臨床上尚無(wú)有效的治療方法[13]。新生兒腦組織對(duì)缺血缺氧最為敏感，本研究采用7日齡大鼠建立HIE模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死面積增加，海馬神經(jīng)元腫脹、核固縮壞死嚴(yán)重，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率升高，提示造模成功。大鼠ig迷迭香酸后，迷迭香酸在腦、心臟等多個(gè)臟器中均有分布[14]；姚潤(rùn)心等[15]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡途徑發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予迷迭香酸干預(yù)后，大鼠腦梗死面積下降20%，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著降低，神經(jīng)元腫脹及壞死明顯緩解，提示迷迭香酸可減輕HIE腦損傷及神經(jīng)元凋亡癥狀，在HIE領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

A-對(duì)照組 B-模型組 C-迷迭香酸組 D-GSK-690693組 E-MT6378組 F-迷迭香酸＋MT6378組

表5 迷迭香酸對(duì)HIE大鼠海馬組織cleaved Caspase-3、LC3B、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達(dá)的影響(, n = 8)

細(xì)胞自噬可清除受損的細(xì)胞器，降解并再利用相關(guān)細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、避免細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生能量以避免離子失衡和細(xì)胞壞死，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。但細(xì)胞內(nèi)分子和細(xì)胞器損傷及功能損害進(jìn)一步增強(qiáng)，自噬過(guò)度活化后，神經(jīng)細(xì)胞難以通過(guò)自噬使細(xì)胞回歸正常狀態(tài)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，發(fā)揮神經(jīng)破壞作用[17]。自噬在HIE過(guò)程中的調(diào)控作用一直是臨床研究的熱點(diǎn)之一，但自噬激活在HIE過(guò)程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，還是神經(jīng)破壞作用，還一直存在爭(zhēng)議[5]。Li等[18]用氯喹抑制腦缺血缺氧24 h的新生10日大鼠自噬后，腦損傷加重，神經(jīng)元凋亡增加，推測(cè)自噬激活在HIE過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)抑制HIE大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)自噬后，大鼠腦損傷及神經(jīng)元凋亡減少，推測(cè)HIE過(guò)程中存在自噬過(guò)度激活，損害神經(jīng)。本研究發(fā)現(xiàn)HIE大鼠海馬神經(jīng)元中自噬體及自噬溶酶體形成較多，自噬標(biāo)記蛋白LC3B表達(dá)升高，提示HIE大鼠海馬神經(jīng)元中存在自噬激活現(xiàn)象；迷迭香酸組大鼠海馬神經(jīng)元中自噬溶酶體及自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)降低，提示迷迭香酸發(fā)揮抗HIE腦損傷作用，可能與抑制自噬有關(guān)，與Wang等[19]研究結(jié)果一致。

AMPK及mTOR均可直接磷酸化Ulk1，調(diào)控自噬。研究證實(shí)，缺血缺氧條件下，腦組織糖氧消耗量增大，而腦組織糖元儲(chǔ)備不足，神經(jīng)元能量耗竭嚴(yán)重時(shí)，AMPK激活，一方面能抑制能量消耗，刺激能量產(chǎn)生來(lái)降低腦部能量消耗[20]，另一方面能抑制mTOR活化，減輕Ulk1磷酸化，促進(jìn)AMPK-Ulk1相互作用而激活自噬，清除受損細(xì)胞器來(lái)發(fā)揮腦保護(hù)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元胞質(zhì)中p-AMPK表達(dá)升高，p-Ulk1、p-mTOR表達(dá)異常降低；MT6378進(jìn)一步激活A(yù)MPK后，p-AMPK表達(dá)升高，p-Ulk1、p-mTOR表達(dá)進(jìn)一步降低，大鼠死亡及腦梗死嚴(yán)重，神經(jīng)元自噬及凋亡進(jìn)一步加重，與容志惠等[7]報(bào)道的AMPK過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)Caspase-3蛋白表達(dá)而加重腦損傷觀點(diǎn)相一致，也與Wang等[19]報(bào)道的激活自噬加重HIE腦損傷觀點(diǎn)相一致。迷迭香酸與AMPK抑制劑GSK-690693組作用一致，p-AMPK表達(dá)降低，p-Ulk1、p-mTOR表達(dá)升高，自噬及凋亡降低，提示迷迭香酸抑制HIE海馬神經(jīng)元自噬及凋亡作用，可能與抑制AMPK/mTOR通路激活有關(guān)，而MT6378可逆轉(zhuǎn)迷迭香酸的上述作用。

綜上所述，迷迭香酸可能通過(guò)抑制AMPK/mTOR通路激活，降低海馬神經(jīng)元自噬及凋亡進(jìn)程，發(fā)揮抗HIE腦損傷作用。但HIE海馬神經(jīng)元凋亡及損傷的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，涉及多種途徑多條調(diào)控機(jī)制，迷迭香酸發(fā)揮抗HIE腦損傷的其他機(jī)制還有待深入探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Kamino D, Almazrooei A, Pang E W,.Abnormalities in evoked potentials associated with abnormal glycemia and brain injury in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy [J]., 2021, 132(1): 307-313.

[2] Cinelli D, Lacroix C, Myers K A.Rhythmic sawtooth electroencephalograph waveforms in neonatal hypoxic- ischemic/hypoglycemic encephalopathy [J]., 2019, 91: 70-71.

[3] 甘亞, 何鋼, 劉嵬, 等.迷迭香酸及其衍生物的合成研究進(jìn)展 [J].成都大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2020, 39(2): 131-137.

[4] 曹雯, 張文娟, 潘金鳳, 等.迷迭香酸藥理作用的研究進(jìn)展 [J].廣西中醫(yī)藥, 2019, 42(1): 54-58.

[5] 黃林, 魯利群.細(xì)胞自噬與缺氧缺血性腦損傷的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2019, 16(35): 40-43.

[6] Holczer M, Hajdú B, L?rincz T,.Fine-tuning of AMPK-ULK1-mTORC1 regulatory triangle is crucial for autophagy oscillation [J]., 2020, 10(1): 17803.

[7] 容志惠, 劉偉, 李文斌, 等.單磷酸腺苷激活的蛋白激酶在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中的動(dòng)態(tài)變化 [J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 19(8): 603-607.

[8] Cai C C, Zhu J H, Ye L X,.protects against hypoxic-ischemic brain injury by regulating mitochondria-mediated autophagy via the AMPK pathway [J]., 2019, 2019: 4248529.

[9] 朱波, 楊艷, 蘇仁意, 等.丹參酮IIA注射液對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元自噬及Akt-mTOR通路的影響 [J].中國(guó)中醫(yī)急癥, 2019, 28(2): 204-208.

[10] 郭少波, 徐露露, 蔣麗娟, 等.迷迭香酸的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物及代謝途徑分析 [J].中國(guó)中藥雜志, 2019, 44(21): 4704-4712.

[11] Zadra G, Photopoulos C, Tyekucheva S,.A novel direct activator of AMPK inhibits prostate cancer growth by blocking lipogenesis [J]., 2014, 6(4): 519-538.

[12] Liu T T, Ding T L, Ma Y,.Selective α1B-and α1D-adrenoceptor antagonists suppress noradrenaline- induced activation, proliferation and ECM secretion of rat hepatic stellate cells[J]., 2014, 35(11): 1385-1392.

[13] 黃文卿, 張巍, 劉巍巍.新生兒缺氧缺血性腦病相關(guān)藥物治療的研究進(jìn)展 [J].醫(yī)學(xué)綜述, 2020, 26(22): 4457-4461.

[14] 張磊, 雷玲, 楊薇, 等.迷迭香酸灌胃給予后在大鼠主要臟器組織中分布及排泄的初步研究 [J].中藥藥理與臨床, 2020, 36(5): 79-83.

[15] 姚潤(rùn)心, 王歆燁, 楊瑞瑞.迷迭香酸對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究 [J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué), 2020, 42(5): 448-452.

[16] Maiti P, Peruzzaro S, Kolli N,.Transplantation of mesenchymal stem cells overexpressing interleukin-10 induces autophagy response and promotes neuroprotection in a rat model of TBI [J]., 2019, 23(8): 5211-5224.

[17] Wang Z F, Gao C, Chen W,.Salubrinal offers neuroprotection through suppressing endoplasmic reticulum stress, autophagy and apoptosis in a mouse traumatic brain injury model [J]., 2019, 161: 12-25.

[18] Li P, Hao L, Guo Y Y,.Chloroquine inhibits autophagy and deteriorates the mitochondrial dysfunction and apoptosis in hypoxic rat neurons [J]., 2018, 202: 70-77.

[19] Wang S, Xue H, Xu Y,.Sevoflurane postconditioning inhibits autophagy through activation of the extracellular signal-regulated kinase cascade, alleviating hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats [J]., 2019, 44(2): 347-356.

[20] Li W, Chaudhari K, Shetty R,.Metformin alters locomotor and cognitive function and brain metabolism in normoglycemic mice [J]., 2019, 10(5): 949-963.

[21] Chen S J, Guo D D, Lei B B,.Biglycan protects human neuroblastoma cells from nitric oxide-induced death by inhibiting AMPK-mTOR mediated autophagy and intracellular ROS level [J]., 2020, 42(4): 657-668.

Rosmarinic acid attenuates hypoxic-ischemic encephalopathy in neonatal rats through AMPK/mTOR pathway

ZHAO Yu-xia, CHEN Ying-qian

Children’s Rehabilitation Department, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China

To investigate the effect of rosmarinic acid on neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy (HIE) and regulation on adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway, and preliminarily explore its brain protection mechanism.Seven-day-old SD neonatal rats were randomly divided into control group, model group, rosmarinic acid (300 mg/kg) group, AMPK/mTOR agonist MT6378 (10 mg/kg) group, AMPK inhibitor GSK-690693 (30 mg/kg) group and rosmarinic acid (300 mg/kg) + MT6378 (10 mg/kg) group, with 20 rats in each group.HIE model was established, corresponding drugs were given for intervention, TTC staining method was used to detect cerebral infarction; Transmission electron microscope (TEM) was used to observe the structure damage and autophagy of hippocampal neurons; Immunofluorescence method was used to detect the positive expression level of autophagy marker protein microtubule-associated protein 1 light chain 3B (LC3B); TUNEL method was used to detect neuronal cell apoptosis rate; Immunohistochemistry was used to detect the positive expression level of phosphorylated AMPK (p-AMPK); Western blotting was used to detect the expressions of cleaved Caspase-3, mTOR and its phosphorylated protein (p-mTOR), uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1 (Ulk1) and its phosphorylated protein (p-Ulk1), LC3B in hippocampal tissue.Compared with control group, rats in model group had severe cerebral infarction, hippocampal neuron structure damage and autophagy vacuoles were more formed, autophagy and apoptosis levels were increased, AMPK/mTOR pathway was activated (< 0.05).Compared with model group, rats in rosmarinic acid group and GSK-690693 group had cerebral infarction, hippocampal neuron structural damage and apoptosis and autophagy were weakened, and AMPK/mTOR pathway was inhibited (< 0.05); AMPK/mTOR pathway was further activated in hippocampal tissue of rats in MT6378 group, cerebral infarction, hippocampal neuron structural damage, apoptosis and autophagy were further aggravated (< 0.05); MT6378 reversed the above effects of rosmarinic acid (< 0.05).Rosmarinic acid may play an anti-HIE brain injury effect through inhibiting the activation of AMPK/mTOR pathway and reducing the autophagy and apoptosis of hippocampal neurons.

rosmarinic acid; hypoxic-ischemic encephalopathy; AMPK/mTOR pathway; neonatal rats; autophagy; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)22 - 6897 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.015

2021-06-29

趙玉霞（1983—），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事兒童康復(fù)方面研究。E-mail: zyx09871@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]