李大命 劉洋 唐晟凱 劉燕山 蔣琦辰 何浩然 沈冬冬 張彤晴

摘要：為探究滆湖鲌類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)主要保護(hù)對(duì)象3種鲌類(lèi)遺傳資源狀況，利用線粒體DNA COⅠ基因序列評(píng)價(jià)3種鲌類(lèi)的遺傳多樣性及種群歷史動(dòng)態(tài)。通過(guò)PCR技術(shù)和測(cè)序技術(shù)，獲得長(zhǎng)度為630 bp COⅠ基因片段。序列分析結(jié)果表明，3種鲌類(lèi)COⅠ基因序列堿基組成相似，且具有明顯堿基組成偏向性，A+T的含量高于G+C的含量。翹嘴鲌的46條COⅠ基因片段發(fā)現(xiàn)4個(gè)變異位點(diǎn)，定義了4種單倍型（Hq1-Hq4），翹嘴鲌的單倍型和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.422和0.00 085;蒙古鲌的20條COⅠ基因片段發(fā)現(xiàn)4個(gè)變異位點(diǎn)，定義4種單倍型（Hm1-Hm4），蒙古鲌的單倍型和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.695和0.001 90;達(dá)氏鲌的41條COⅠ基因片段發(fā)現(xiàn)4個(gè)變異位點(diǎn)，定義5種單倍型（Hd1-Hd5），達(dá)氏鲌的單倍型和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.230和0.000 53。中性檢驗(yàn)和歧點(diǎn)分布分析顯示，3種鲌類(lèi)在歷史進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了不明顯的種群擴(kuò)張。整體來(lái)看，滆湖鲌類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)3種鲌類(lèi)的遺傳多樣性水平較低，種群遺傳組成趨于單一化，需要采取措施增加鲌類(lèi)種群數(shù)量，提高其遺傳多樣性水平。

關(guān)鍵詞：國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū);遺傳多樣性;COⅠ基因;翹嘴鲌;蒙古鲌;達(dá)氏鲌

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.4;S931?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0177-05

收稿日期：2021-04-08

基金項(xiàng)目：江蘇省水生生物資源重大專(zhuān)項(xiàng)暨首次水生野生動(dòng)物資源普查（編號(hào)：ZYHB16-3）;2019年淡水漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)（編號(hào)：2019-SJ-018-2）;2020年漁業(yè)生態(tài)監(jiān)測(cè)（編號(hào)：2020-SJ-016-2）。

作者簡(jiǎn)介：李大命（1981—），男，河南省汝南人，博士，副研究員，主要從事大水面漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)和評(píng)估研究。E-mail：ldm8212@126.com。

國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)是依法予以特殊保護(hù)和管理的水產(chǎn)種質(zhì)資源主要生長(zhǎng)繁殖區(qū)域，以實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)種質(zhì)資源及其生存環(huán)境的保護(hù)和合理利用，水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)的建立對(duì)于保護(hù)水產(chǎn)種質(zhì)資源起到重要作用[1]。多年來(lái)，受氣候變化、過(guò)度捕撈、環(huán)境污染、工程建設(shè)的影響，水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)的生態(tài)環(huán)境及主要保護(hù)對(duì)象受到巨大威脅，亟待開(kāi)展水產(chǎn)種質(zhì)資源遺傳狀況的研究和保護(hù)[2]。滆湖鲌類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)位于江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)西南處滆湖水域的北端，保護(hù)區(qū)面積為1 520 hm2，其中核心區(qū)面積509 hm2，實(shí)驗(yàn)區(qū)面積1 011 hm2。保護(hù)區(qū)特別保護(hù)期為全年，主要保護(hù)對(duì)象為翹嘴鲌（Culter alburnus）、蒙古鲌（Culter mongolicus）及達(dá)氏鲌（Culter dabryi）。迄今，尚無(wú)有關(guān)于保護(hù)區(qū)保護(hù)對(duì)象3種鲌類(lèi)遺傳狀況的研究。

遺傳多樣性是評(píng)價(jià)物種資源狀況的一個(gè)重要指標(biāo)，是物種適應(yīng)周?chē)h(huán)境變化、維持生存和進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。因此，掌握物種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是開(kāi)展生物種質(zhì)資源保護(hù)和利用的前提和基礎(chǔ)。魚(yú)類(lèi)的線粒體基因組是一種雙鏈DNA分子，具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、編碼效率高、母系遺傳、重組率低、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，已成為群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記[4-5]。COⅠ基因是位于線粒體DNA的蛋白質(zhì)編碼基因，其長(zhǎng)度適宜，進(jìn)化速度適中又相對(duì)保守，被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)物種鑒定及群體遺傳學(xué)領(lǐng)域，研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)魚(yú)類(lèi)種質(zhì)遺傳資源提供了重要依據(jù)[6-9]。

本研究利用線粒體DNA的COⅠ基因序列，首次探討滆湖鲌類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)主要保護(hù)對(duì)象的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果可為掌握3種鲌類(lèi)的種質(zhì)資源遺傳狀況、科學(xué)保護(hù)及合理利用水產(chǎn)種質(zhì)資源提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

2019年7—11月和2020年5月、9月，在滆湖鲌類(lèi)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)開(kāi)展?jié)O業(yè)資源調(diào)查。采用三層刺網(wǎng)采集魚(yú)類(lèi)樣本，魚(yú)類(lèi)鑒定依據(jù)《江蘇魚(yú)類(lèi)志》[10]。共采集翹嘴鲌46尾，蒙古鲌20尾，達(dá)氏鲌41尾，測(cè)定樣本體長(zhǎng)與體質(zhì)量?，F(xiàn)場(chǎng)剪取樣本的肌肉組織，置于無(wú)水乙醇中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室用于提取基因組DNA。

1.2 DNA提取、PCR和測(cè)序

采用廣譜性基因組提取試劑盒提取肌肉組織基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA完整性及紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。

COⅠ基因擴(kuò)增引物為F1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′和R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′[11]。COⅠ基因的PCR體系為50.0 μL，其中，含有10×PCR Buffer （含 20 mmol/L Mg2+）5.0 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.4 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，DNA 模板1.0 μL（80 ng/μL），剩余體積用超純水補(bǔ)足。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，將合格的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列分析

使用BioEdit7.05.3軟件[12]讀取序列并輔以人工校對(duì)，利用Clustal X1.83軟件[13]進(jìn)行多序列比對(duì)。采用MEGA 7.0軟件[14]計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)及保守位點(diǎn)，計(jì)算種內(nèi)及種間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建3種鲌類(lèi)單倍型的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用DnaSP 6.0軟件[15]確定單倍型種類(lèi)和個(gè)數(shù)，計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)（h）和核苷酸多樣性指數(shù)（π），并進(jìn)行Tajimas D和Fus Fs中性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 COⅠ基因序列堿基組成

經(jīng)比對(duì)和分析，獲得3種鲌類(lèi)COⅠ基因片段，長(zhǎng)度為630 bp，無(wú)堿基插入或缺失。翹嘴鲌4種堿基A、T、G、C的平均含量分別為26.0%、28.3%、18.0%和27.7%。同樣，蒙古鲌4種堿基的平均含量分別為25.8%、27.3%、18.2%和28.7%，達(dá)氏鲌4種堿基的平均含量分別為26.3%、28.7%、17.6%和27.4%。由表1可知，3種鲌類(lèi)的堿基組成相近，堿基G的含量最低，堿基A+T含量高于 G+C 含量，表現(xiàn)出明顯堿基偏向性，其中，達(dá)氏鲌的A+T含量（55.0%）最高，蒙古鲌的A+T含量（53.1%）最低。

2.2 群體遺傳多樣性

由表2可知，翹嘴鲌46條COⅠ基因序列有4個(gè)變異位點(diǎn)，其中，1個(gè)是單一信息位點(diǎn)，3個(gè)是簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，定義4種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.422和0.000 85;蒙古鲌20條 COⅠ 基因序列有4個(gè)變異位點(diǎn)，全部是簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，定義4種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.695和0.001 90;達(dá)氏鲌41條COⅠ基因序列有4個(gè)變異位點(diǎn)，其中，3個(gè)是單一信息位點(diǎn)，1個(gè)是簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，定義5種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.230和0.005 3。整體來(lái)看，3種鲌類(lèi)的遺傳多樣性較低，其中蒙古鲌遺傳多樣性最高，達(dá)氏鲌遺傳多樣性最低。

翹嘴鲌群體有4種單倍型（Hq1～Hq4）組成，其中，單倍型Hq2數(shù)量最多，有34個(gè)，占群體比例為73.9%，單倍型Hq4有2個(gè)，單倍型Hq1和Hq3各有1個(gè);蒙古鲌群體有4種單倍型（Hm1～Hm4）組成，單倍型Hm2數(shù)量最多，有10個(gè)，占群體的比例為50.0%，單倍型Hm1和Hm4各有4個(gè)，單倍型Hm3有2個(gè);達(dá)氏鲌群體有5種單倍型（Hd1～Hd5）組成， 單倍型Hd1數(shù)量最多，有36個(gè)，占群體的比達(dá)87.8%，單倍型Hd4有2個(gè)，單倍型Hd2、Hd3和Hd5各有1個(gè)。

2.3 種內(nèi)和種間遺傳距離

3種鲌類(lèi)的種內(nèi)遺傳距離均為0.000～0.005，翹嘴鲌和達(dá)氏鲌的種內(nèi)遺傳距離均值為0.001，蒙古鲌的種內(nèi)遺傳距離均值為0.002。3種鲌類(lèi)的種間遺傳距離為0.031～0.043，其中，蒙古鲌和達(dá)氏鲌間的遺傳距離最大，蒙古鲌和翹嘴鲌之間的遺傳距離最小。種內(nèi)遺傳距離均小于2%，種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的15.5～43.0倍（表3）。

2.4 分子系統(tǒng)發(fā)育

以鯉（Cyprinus carpio，MK843657.1）為外類(lèi)群，基于NJ法構(gòu)建鲌類(lèi)的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并應(yīng)用Bootstrap（重復(fù)次數(shù)1 000）檢驗(yàn)聚類(lèi)樹(shù)各分支置信度。由圖1可知，3種鲌類(lèi)均單獨(dú)聚為獨(dú)立分支，且節(jié)點(diǎn)的置信度水平較高，翹嘴鲌分支的支持率為99%，蒙古鲌和達(dá)氏鲌的分支支持率為100%，表明COⅠ基因可作為鲌類(lèi)鑒定的有效分子標(biāo)記[8]。同時(shí)可看出，達(dá)氏鲌和翹嘴鲌最先聚集在一起，然后與蒙古鲌聚集在一起，表明達(dá)氏鲌和翹嘴鲌的親緣關(guān)系較近，與蒙古鲌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與王偉的研究結(jié)果[16]一致。

2.5 群體進(jìn)化歷史

由表4可知，利用DnaSP 6.0對(duì)3種鲌類(lèi)進(jìn)行Tajiams D和FuFs中性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，3種鲌類(lèi)的中性檢驗(yàn)值均為負(fù)值，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果不顯著（P>0.1）。由圖2可知，3種鲌類(lèi)的歧點(diǎn)分布圖中，歧點(diǎn)分布曲線呈明顯的單峰型。

3 討論

3.1 3種鲌類(lèi)的遺傳多樣性

通常采用單倍型多樣性指數(shù)（h）和核苷酸多樣性指數(shù)（π）2個(gè)常用參數(shù)衡量物種遺傳多樣性的高低，h和π值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富[17]。本研究采用COⅠ基因片段，首次分析滆湖鲌類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)主要保護(hù)對(duì)象的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，翹嘴鲌、蒙古鲌和達(dá)氏鲌的單倍型多樣性分別為0.422、0.695和0.230，核苷酸多樣性分別為0.000 85、0.001 90和0.000 53。Grant和Bowen通過(guò)研究，將魚(yú)類(lèi)的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)大小的閾值分別設(shè)定為0.5和0.005[18]。本研究結(jié)果表明，3種鲌類(lèi)中只有蒙古鲌的單倍型多樣性大于0.5，表明保護(hù)區(qū)3種鲌類(lèi)的遺傳資源較為貧乏。與三峽庫(kù)區(qū)翹嘴鲌（h：0.972 2～0.990 5，π：0.002 4～0.014 1）、蒙古鲌（h：0.866 7～1，π：0.002 2～0.002 4）、達(dá)氏鲌（h：0.969 0～1.000 0，π：0.033 0～0.071 5）[19]、長(zhǎng)江中下游5個(gè)達(dá)氏鲌地理群體（h：0.412 3，π：0.001 1）[20]及長(zhǎng)江流域湖北段和江蘇段5個(gè)蒙古鲌群體（h：0.664，π：0.002）[21]的遺傳多樣性相比，同樣表明保護(hù)區(qū)3種鲌類(lèi)的遺傳多樣性指數(shù)較小。多年來(lái)，滆湖環(huán)境污染嚴(yán)重，藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生，水生植物消失，涉水工程項(xiàng)目建設(shè)較多，加之過(guò)度捕撈等多種不利因素的影響，導(dǎo)致保護(hù)區(qū)魚(yú)類(lèi)的棲息

環(huán)境被破壞，魚(yú)類(lèi)的小型化、低齡化趨勢(shì)加劇，種群資源量下降，遺傳多樣性喪失[22-25]。另外，受水利工程建設(shè)的影響，滆湖處于相對(duì)封閉狀態(tài)，與周邊水體的魚(yú)類(lèi)群體基因交流受阻，進(jìn)一步導(dǎo)致滆湖魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源遺傳多樣性下降[26]。

一般來(lái)說(shuō)，魚(yú)類(lèi)的遺傳多樣性特征與進(jìn)化歷史密切相關(guān)。Grant和Bowen根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性的關(guān)系，將群體遺傳多樣性分為4種模式：第一類(lèi)模式為低h和低π（h<0.5，π<0.005），表明種群近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng);第二類(lèi)模式為高h(yuǎn)和低π（h≥ 0.5，π<0.005），表示是受瓶頸效應(yīng)后群體數(shù)量的迅速擴(kuò)張導(dǎo)致;第三類(lèi)模式為低h和高π（h<0.5，π ≥ 0.005），表示群體經(jīng)歷了輕微的瓶頸效應(yīng)，但沒(méi)有影響到核苷酸變異;第四類(lèi)模式為高h(yuǎn)和高π（h≥ 0.5，π≥0.005），表示群體穩(wěn)定且具有比較悠久的進(jìn)化歷史[18]。本研究結(jié)果顯示，翹嘴鲌和達(dá)氏鲌的單倍型多樣性<0.5，核苷酸多樣性<0.005，屬于第一種類(lèi)型;蒙古鲌單倍型多樣性>0.5，核苷酸多樣性<0.005，屬于第二種類(lèi)型，這表明3種鲌類(lèi)近期均經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，群體尚未有足夠長(zhǎng)的時(shí)間積累遺傳變異。3種鲌類(lèi)的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tajimas D 值和Fus Fs值均為負(fù)值，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果不顯著，表明進(jìn)化過(guò)程中偏離了中性選擇，發(fā)生輕微的有害突變或有害突變被清除[27-28]。3種鲌魚(yú)的歧點(diǎn)分布圖呈現(xiàn)單峰型[29]，綜合來(lái)看，表明3種鲌魚(yú)進(jìn)化歷史上經(jīng)歷了不明顯的種群擴(kuò)張過(guò)程。

3.2 3種鲌類(lèi)的遺傳結(jié)構(gòu)

Hebert等基于COⅠ序列，對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門(mén)、13 320 個(gè)物種進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，種內(nèi)遺傳距離多在2%以下[30]。本研究結(jié)果顯示，翹嘴鲌、蒙古鲌和達(dá)氏鲌的種內(nèi)遺傳距離均為0.000～0.005，明顯<2%，這說(shuō)明在保護(hù)區(qū)內(nèi)3種鲌類(lèi)群體是一個(gè)自由交配的群體，群體內(nèi)個(gè)體間存在廣泛的基因交流。從單倍型組成來(lái)看，特定類(lèi)型的單倍型在群體中占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì)，翹嘴鲌的優(yōu)勢(shì)單倍型Hq2有34個(gè)，占群體的比例為73.9%，蒙古鲌的優(yōu)勢(shì)單倍型Hm2有10個(gè)，占群體的比例為50%，達(dá)氏鲌的優(yōu)勢(shì)單倍型Hd1有36個(gè)，占群體的比例為87.8%，說(shuō)明3種鲌類(lèi)群體的遺傳組成趨于單一化，這可能由于鲌類(lèi)的群體數(shù)量較小，受遺傳漂變的影響所致[31]。從保護(hù)生物學(xué)的角度來(lái)看，數(shù)量較少的單倍型容易丟失，對(duì)種群的遺傳多樣性產(chǎn)生較大影響，更需要加大保護(hù)力度。

3.3 鲌類(lèi)種質(zhì)資源保護(hù)

本研究顯示，種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)的3種鲌類(lèi)遺傳多樣性水平較低，種群遺傳組成單一化，需要采取措施保護(hù)和修復(fù)鲌類(lèi)資源，提高遺傳多樣性水平：（1）控制環(huán)境污染，治理藍(lán)藻水華，改善魚(yú)類(lèi)的棲息環(huán)境;（2）構(gòu)建水域生態(tài)牧場(chǎng)和建設(shè)人工魚(yú)巢，為繁殖和孵化提供基質(zhì)和空間;（3）開(kāi)展增殖放流，補(bǔ)充魚(yú)類(lèi)資源量，優(yōu)化魚(yú)類(lèi)遺傳結(jié)構(gòu);（4）強(qiáng)化執(zhí)法，嚴(yán)厲打擊非法捕撈，保護(hù)魚(yú)類(lèi)繁殖和生長(zhǎng)。

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