榮譽(yù)磊 周志林 趙冬蘭 唐君 彭湘君 趙玉琪 宗凱 呂亞寧 姚改芳 胡康棣 張華

摘要：對(duì)甘薯、番茄、擬南芥中63個(gè)SPL基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析、保守蛋白基序（Motif）分析，篩選歸納出同源性較高的2個(gè)分支的12個(gè)SPL基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析、核定位預(yù)測(cè)等，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明這些基因的功能可能較為保守。通過(guò)對(duì)番茄中的SPL基因Solyc05g015510.2、Solyc10g078700.1進(jìn)行表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因可能參與調(diào)控果實(shí)成熟衰老進(jìn)程。另外，通過(guò)對(duì)非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析得知，擬南芥中的AT5G43270可能參與對(duì)鹽脅迫、熱脅迫條件下的響應(yīng)，AT1G27360、AT1G27370可能參與熱脅迫條件下的響應(yīng)，AT2G42200可能參與冷脅迫條件下的響應(yīng)，而AT3G57920在非生物脅迫條件下表達(dá)量沒(méi)有特別明顯的變化，表明AT3G57920可能不參與非生物脅迫下的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：SPL轉(zhuǎn)錄因子家族;番茄;甘薯;擬南芥;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0074-10

收稿日期：2021-03-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2019YFD100070、2019YFD100071、2019YFD1001300、2019YFD1001303）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-10-B1）;國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31670278、31970200、31970312、31901993、31872078）;安徽省科技重大項(xiàng)目（編號(hào)：16030701073）;中央高?；A(chǔ)研究基金（編號(hào)：JZ2018HGTB0241、JZ 20181）。

作者簡(jiǎn)介：榮譽(yù)磊（1992—），男，安徽阜陽(yáng)人，碩士，研究方向?yàn)椴珊笊飳W(xué)。E-mail：990953597@qq.com。

通信作者：胡康棣，博士，副教授，研究方向?yàn)椴珊笊飳W(xué)，E-mail：kangdihu@hfut.edu.cn;張 華，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)，E-mail：hzhanglab@hfut.edu.cn。

植物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控發(fā)生在基因表達(dá)的初期，是許多基因表達(dá)調(diào)控的主要方式。在此調(diào)控過(guò)程中，被稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)特異結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子，控制著一系列相關(guān)基因的表達(dá)[1-2]。squamosa promoter binding protein box（簡(jiǎn)稱SBP-box）基因別稱 squamosa promoter binding protein like（簡(jiǎn)稱SPL）基因，可編碼一類綠色植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多個(gè)不同并且重要的生物過(guò)程，如葉片發(fā)育[3]、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和大小[4]、花和果實(shí)的發(fā)育[5-9]、擬南芥花粉孢子的形成[10]和響應(yīng)赤霉素（GA）信號(hào)[11]等。SPL基因最初是從金魚(yú)草（Antirrhinum majus）中分離出來(lái)，人們把它命名為SBP1和SBP2，研究發(fā)現(xiàn)SPL蛋白通過(guò)結(jié)合MADS-box基因啟動(dòng)子的squamosa元件，控制植物花的早期發(fā)育。已知的SPL家族成員都具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SBP），大約含有76個(gè)氨基酸殘基，具有2個(gè)典型的C3H（C—C—CH）和C2HC（C—C—H—C）鋅指結(jié)構(gòu)特征，其 C端區(qū)域具有核定位信號(hào)[12]，能介導(dǎo)SPL蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。SPL基因由不同數(shù)量的外顯子組成，但所有陸地植物的SBP結(jié)構(gòu)域都是由第一和第二外顯子編碼的，并且這2個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子位置也是保守的[13]。SBP鋅指遵循 CC—x—C—x—C—x—[HC]—x—C—x—C—x—H—x—C（x表示氨基酸）的一般模式，其他3種組氨酸都很保守，但不參與鋅的結(jié)合[6]。此外，核磁共振技術(shù)（NMR）被用來(lái)研究擬南芥中SBP轉(zhuǎn)錄因子SPL4 和SPL7的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[14]。體外試驗(yàn)表明，SBP鋅指結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合序列-TNCGTACAA-[15]，然而，除了它們與DNA結(jié)合的能力之外，人們對(duì)這些潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的生理功能知之甚少。

自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，SBP-box基因家族在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[16]、水稻（Oryza sativa）[17]、玉米（Zea mays）[18]、小麥（Triticum aestivum）[19]和番茄（Solanum lycopersicum）[20]等植物中均有報(bào)道。在擬南芥中，有11個(gè)SPL基因受 miR156 調(diào)控，已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR156 通過(guò)轉(zhuǎn)錄切割以及翻譯抑制來(lái)調(diào)節(jié)SPL3表達(dá)[21]，擬南芥AtSPL1基因能夠參與植物發(fā)育和對(duì)伏馬菌素B1的敏感性[22]。擬南芥SBP-box基因家族轉(zhuǎn)錄因子參與花期的轉(zhuǎn)變，有報(bào)道闡明了它們?cè)跀M南芥發(fā)育中的作用，分析了可能的同源基因SPL9和SPL15的單突變體和雙突變體表型，發(fā)現(xiàn)這些基因在控制生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著冗余作用。此外，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，它們的功能缺失導(dǎo)致花序結(jié)構(gòu)改變和分枝增強(qiáng)[23]。對(duì)LeSPL-CNR的研究表明，SBP-box基因在調(diào)控番茄果實(shí)成熟過(guò)程中起著重要作用，同時(shí)也證明了番茄的大量自然變異受表觀遺傳過(guò)程控制的論點(diǎn)[24]。部分SPL可通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子來(lái)發(fā)揮功能，并且也能參與葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成相關(guān)的代謝過(guò)程[25]。但是SPL基因家族在甘薯發(fā)育中的功能相關(guān)研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，在番茄和擬南芥中的基因功能研究也不是很全面，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)甘薯、擬南芥、番茄中SPL家族成員理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)基因序列分析、氨基酸序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)域及轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，并對(duì)可能參與的功能進(jìn)行探討，以期為進(jìn)一步研究SPL基因在甘薯、番茄、擬南芥中的功能提供借鑒。

1 試驗(yàn)方法

1.1 SPL基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析與保守蛋白基序（motif）分析

從Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）網(wǎng)站下載擬南芥和番茄中已鑒定的33條SPL蛋白序列作為參考，其中擬南芥中16條，番茄中17條，利用甘薯網(wǎng)站（http：//sweetpotato.plantbiology.msu.edu）中蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)blastp 檢索甘薯蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得30條候選序列。利用MEGA 7.0軟件使用Neighbor-Joining法構(gòu)建SPL家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用iTOL工具網(wǎng)站（http：//itol.embl.de/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行優(yōu)化。利用MEME網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對(duì)SPL蛋白基序（motif）進(jìn)行分析。將得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與motif分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，找到同源性較高且系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果和motif分析結(jié)果吻合的SPL分支進(jìn)行深入分析。

1.2 SPL基因家族理化性質(zhì)分析與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用ExPASy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)2個(gè)同源性較高的分支中的12個(gè)SPL基因的序列長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量等理化參數(shù)進(jìn)行分析，并利用核定位信號(hào)NLS Mapper工具（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的核定位信號(hào)，隨后通過(guò) Cell-PLoc 2.0 預(yù)測(cè)了這12個(gè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

1.3 同源SPL蛋白結(jié)構(gòu)域分析及氨基酸序列比對(duì)

將上述篩選得到的2個(gè)分支12個(gè)SPL基因利用SMART（http：//smart.embl.de/）網(wǎng)站分別進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，并利用ESPript 3.0（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。

1.4 番茄中SPL基因表達(dá)量分析

將篩選得到的2個(gè)分支中番茄的SPL基因利用TomExpress（http：//tomexpress.toulouse.inra.fr/）網(wǎng)站，挖掘基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行繪圖和分析。

1.5 非生物脅迫條件下的擬南芥中SPL基因表達(dá)量分析

將上述篩選得到的2個(gè)分支中擬南芥中的SPL基因利用ePlant工具（http：//bar.utoronto.ca/eplant/）獲取擬南芥中非生物脅迫條件下SPL基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行繪圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯、番茄、擬南芥中SPL家族蛋白進(jìn)化樹(shù)與motif分析

將BLAST同源比對(duì)獲得的63條SPL家族蛋白利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示，3個(gè)分支中，Solyc04g064470.1獨(dú)自在一個(gè)分支中，表明較其他家族成員親緣性較遠(yuǎn)，第2個(gè)分支中包括AT5G18830、Solyc01g080670.2、itf01g13650.t1，第3個(gè)分支包括其余甘薯、番茄、擬南芥中59個(gè)SPL基因。其中甘薯itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1與番茄Solyc05g015510.2以及擬南芥AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360在同一個(gè)分支，說(shuō)明它們親緣性較高，可能具有相似的基因功能。甘薯itf15g02920.t1、itf01g24210.t1與擬南芥AT2G42200、AT3G57920以及番茄Solyc10g078700.1在同一個(gè)分支，說(shuō)明它們親緣性較高，可能具有相似的基因功能。

隨后，利用MEME網(wǎng)站分析甘薯、番茄、擬南芥中63個(gè)SPL家族蛋白的保守蛋白基序（motif）。由圖2可以看到SBP-box 蛋白基序分布，不同顏色的方塊代表不同基序。其中，itf05g01080t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1與Solyc05g015510.2以及AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的motif具有很大的相似性，這一點(diǎn)與基因家族進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果相符合，另外，itf15g02920.t1、 itf01g24210.t1與AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1的motif結(jié)果也很相似，與進(jìn)化樹(shù)結(jié)果一致。

2.2 甘薯、番茄、擬南芥中SPL蛋白家族理化性質(zhì)與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)對(duì)圖2中保守性較高的2個(gè)分支中12個(gè)SPL基因核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行理化分析，結(jié)果（表1）表明，蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）序列長(zhǎng)度為 1 038～1 392 bp，蛋白質(zhì)編碼序列為345～463個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為37 017.17～50 418.90 g/mol，等電點(diǎn)（pI）介于7.94～9.11之間。在蛋白質(zhì)序列的整個(gè)區(qū)域內(nèi)，對(duì)SPL蛋白的核定位信號(hào)序列（NLS）進(jìn)行分析，通過(guò) NLS Mapper 網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)。如表1所示，5個(gè)擬南芥SPL基因中有3個(gè)含有潛在的 NLS，2個(gè)番茄SPL基因都沒(méi)有含有潛在的NLS，5個(gè)甘薯SPL基因中只有1個(gè)含有潛在的 NLS，說(shuō)明部分SPL蛋白可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

同時(shí)，利用Cell-PLoc 2.0 預(yù)測(cè)了這12個(gè)SPL家族蛋白的亞細(xì)胞定位。如表2所示，12個(gè)SPL家族蛋白均定位在細(xì)胞核內(nèi)，值得注意的是其中有3個(gè)SPL家族蛋白也存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

2.3 SPL家族蛋白的結(jié)構(gòu)域分析及氨基酸序列比對(duì)

對(duì)上述12個(gè)同源性較高的SPL基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析（圖3），發(fā)現(xiàn)這12個(gè)基因都具有典型的SBP結(jié)構(gòu)域，且第1個(gè)分支的SBP結(jié)構(gòu)域的位置在第170～250個(gè)氨基酸，第2個(gè)分支的SBP結(jié)構(gòu)域的位置在第50～160個(gè)氨基酸，說(shuō)明這2個(gè)分支都具有保守的SBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，但SBP結(jié)構(gòu)域的位置明顯不同。

通過(guò)對(duì)上述SPL基因進(jìn)行氨基酸序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1、Solyc05g015510.2、AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的序列之間具有差異性，然而均具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域（圖4-a），保守的SBP結(jié)構(gòu)域包括2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和NLS，第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與NLS有重疊，itf15g02920.t1、itf01g24210.t1、AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1也具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域（圖4-b），也具有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和1個(gè)NLS。該結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸和組氨酸的基序，表明在分子層面這些基因也具有高度同源性。

2.4 番茄中SPL基因表達(dá)水平分析

分析番茄中2個(gè)的SPL基因表達(dá)量（圖5）可知，Solyc10g078700.1在番茄組織中大部分時(shí)間表達(dá)量是處于一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)，然而在開(kāi)花后4 d表達(dá)量急速增加，在開(kāi)花后41 d及以后，表達(dá)量減少，這說(shuō)明這個(gè)基因可能參與果實(shí)成熟過(guò)程中相關(guān)通路的途徑。Solyc05g015510.2在其他組織中的表達(dá)量在0.04左右，但是在果實(shí)破色期到紅熟期之間，基因表達(dá)量快速上升，這表明該基因可能參與果實(shí)成熟衰老的過(guò)程。

2.5 擬南芥SPL基因在非生物脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄水平分析

篩選出來(lái)的12個(gè)SPL基因中，有5個(gè)擬南芥基因，在網(wǎng)站里檢索這5個(gè)SPL基因在冷、熱、干旱等脅迫下基因的表達(dá)量。如圖6-A所示，AT5G43270在遭受鹽脅迫、熱脅迫0.5 h后幼苗中SPL基因表達(dá)量急速下降，在這之后的24h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，有的甚至超過(guò)對(duì)照組，說(shuō)明AT5G43270可能參與擬南芥對(duì)鹽脅迫、熱脅迫條件下的反應(yīng)。圖6-B 中AT1G27360在遭受熱脅迫12 h后幼苗中SPL基因表達(dá)量急速上升，超過(guò)對(duì)照組，說(shuō)明AT1G27360可能參與熱脅迫條件下的響應(yīng)。圖6-C中AT1G27370在遭受熱脅迫6 h后幼苗中SPL基因表達(dá)量急速上升，在8 h左右時(shí)超過(guò)對(duì)照組，說(shuō)明AT1G27370可能參與熱脅迫條件下的響應(yīng)。而根中基因表達(dá)量與對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯差異。由圖6-D可知， 另外一個(gè)分支中的AT2G42200在冷脅迫條件下 12 h 后幼苗中SPL基因表達(dá)量急劇上升，說(shuō)明AT2G42200可能參與冷脅迫條件下的響應(yīng)，根中的SPL基因表達(dá)量在受到非生物脅迫時(shí)幾乎沒(méi)有變化。由圖6-E可知，AT3G57920在非生物脅迫條件下表達(dá)量沒(méi)有特別明顯的變化，說(shuō)明AT3G57920可能不參與非生物脅迫條件下的響應(yīng)，根中的基因表達(dá)量在受到非生物脅迫時(shí)也幾乎沒(méi)有變化。

3 討論

本研究利用BLAST同源比對(duì)，獲得甘薯、番茄、擬南芥中的63個(gè)SPL家族蛋白，并進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明甘薯itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1與番茄Solyc05g015510.2以及擬南芥AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360在同一個(gè)分支，這7個(gè)SPL基因雖然不在同一物種中，但是親緣性較高。甘薯itf15g02920.t1、itf01g24210.t1與擬南芥AT2G42200、AT3G57920以及番茄Solyc10g078700.1在同一個(gè)分支，說(shuō)明它們親緣性較高。motif分析結(jié)果與基因家族進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果相符合，進(jìn)而歸納出2個(gè)SPL基因家族的分支，基因結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)這2個(gè)分支的12個(gè)SPL基因都具有典型的SBP結(jié)構(gòu)域。

通過(guò)對(duì)上述12個(gè)SPL基因進(jìn)行氨基酸序列的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，其中含有itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1、Solyc05g015510.2、AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的分支序列之間雖然具有差異性，但是均具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，保守的SBP結(jié)構(gòu)域包括2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和NLS，第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與NLS有重疊，itf15g02920.t1、itf01g24210.t1、AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1也具有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和1個(gè)NLS。該結(jié)構(gòu)域的相同結(jié)構(gòu)表明在分子層面這些基因也具有結(jié)構(gòu)同源性。

最后進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，表明Solyc10g078700.1這個(gè)基因可能參與果實(shí)成熟過(guò)程中相關(guān)通路的途徑，Solyc05g015510.2這個(gè)基因可能參與果實(shí)成熟衰老的過(guò)程，擬南芥中AT5G43270可能參與擬南芥對(duì)鹽脅迫、熱脅迫條件下的反應(yīng)，AT1G27360、AT1G27370可能參與熱脅迫條件下的響應(yīng)。而另外一個(gè)分支中可以看到，AT2G42200在冷脅迫條件下12 h后幼苗中SPL基因表達(dá)量上升，說(shuō)明AT2G42200可能參與冷脅迫條件下的響應(yīng)，AT3G57920在非生物脅迫條件下表達(dá)量沒(méi)有特別明顯的變化。本研究初步篩選了甘薯、番茄、擬南芥中的SPL基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、蛋白基序、氨基酸序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)域及轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，并對(duì)可能參與的功能進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步研究SPL基因在番茄、擬南芥、甘薯中的功能提供了一定借鑒作用。

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