崔坤磊,尹希杰,李艷利,楊海麗,裴盛祥,蘇 靜

(1.河南理工大學,河南 焦作454000; 2.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門361005)

隨著時代的進步和科技的發(fā)展, 在全球范圍內, 對氮污染的關注不斷提高, 越來越多的人認為其是繼生物多樣性減少和全球變暖之后的第三大環(huán)境問題[1]。水體生態(tài)系統(tǒng)由于活性氮的過量輸入而遭到污染, 會導致河口、沿海和地表水體的富營養(yǎng)化以及季節(jié)性缺氧問題, 還會威脅到飲用水的安全[2-4]。測定水體中硝酸鹽的氮、氧同位素組成, 能夠對硝酸鹽的來源進行示蹤, 可以更準確地指示其遷移轉化規(guī)律, 為水體氮循環(huán)研究提供更為豐富和準確的信息,從而制定出更具有針對性的應對措施[5]。

目前國內能夠對硝酸鹽中氮、氧同位素同時測定的前處理方法有離子色譜法[6-8]、化學轉化法[9-13]和細菌反硝化法[14-19]。其中, 離子色譜法容易受到樣品中溶解性有機物的干擾, 不適用于高鹽度樣品，并且所需樣品量較大[5,8,20-22]; 化學轉化法則需要借助重金屬鎘和具有高毒性、爆炸性試劑疊氮化鈉對硝酸鹽進行還原, 環(huán)境友好性較差[10,12,23]; 細菌反硝化法則是選用自然界中已經存在的特定反硝化細菌[缺少氧化亞氮(N2O)還原酶], 直接對樣品進行生物處理, 反應過程安全高效, 成本低廉, 整個實驗過程中不涉及有毒試劑使用, 是當前硝酸鹽氮、氧同位素同時測定的一種主要測試方法[14,18-20,22,24-25], 只是該方法在前期準備期間需要涉及微生物培養(yǎng)方面的專業(yè)設備和知識, 導致其應用受到一定的限制[20,24,26-27]。

本實驗針對3種自然水體(海水、湖水和自來水), 在不同時間采用細菌反硝化法進行了3個批次硝酸鹽氮、氧同位素的重復性分析測定, 來驗證該方法對不同類型樣品中硝酸鹽氮、氧同位素測定的適用性, 以及較長測試周期內測定結果的重現(xiàn)性和準確性, 希望能夠為細菌反硝化法測定硝酸鹽氮、氧同位素技術在國內的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種選擇與實驗原理

本實驗所采用的試劑配制及實驗條件主要是在前人的經驗基礎上根據本實驗室相關實驗結論綜合得出。

1.2 主要實驗儀器

主要實驗儀器有MAT 253穩(wěn)定同位素比質譜儀(Thermo Fisher公司)、Gas-Bench連續(xù)流氣體引入裝置、兩級液氮冷阱預富集裝置、自動進樣器(CTC analytics Pal)等。

1.3 實驗藥品

主要培養(yǎng)基和試劑包括：胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、KNO3(GR)、KH2PO4(GR)、(NH4)2SO4(GR)、NH4Cl(GR)、磺胺、N-(1-萘基)乙二胺、NaOH(GR)、HCl(GR)、消泡劑(美國Sigma公司)等。

1.4 試劑配制

1%磺胺溶液：稱取磺胺1.0 g溶于100 mL 3 mol/L HCl中, 充分混勻后冷藏保存。

0.02%萘基乙二胺溶液：稱取N-(1-萘基)乙二胺0.02 g 溶于100 mL超純水中, 用棕色試劑瓶或用錫紙包裹, 冷藏保存。

1.5 實驗步驟

將復壯后的細菌進行擴大培養(yǎng), 待菌液通過顯色檢驗后, 濃縮分裝, 然后使用高純N2進行吹掃, 將解凍后的標準溶液和樣品用氣密性注射器加入到菌液中進行過夜反應, 次日加入NaOH終止反應并吸收CO2, 然后對反應產生的N2O氣體進行上機測定, 分析其氮、氧同位素組成。具體實驗步驟如圖1所示。

圖1 細菌反硝化法實驗流程

1.6 硝酸鹽氮氧標準樣品

本實驗所采用的標準物質溶液是以IAEA認證的USGS-32(δ15NAir=+180‰, δ18OV-SMOW=+25.7‰)和USGS-34(δ15NAir=-1.8‰, δ18OV-SMOW=-27.9‰)兩種硝酸鉀同位素標準物質配制出母液, 再將兩種標準物質母液以體積比1∶3、2∶2和3∶1混合, 然后再加上兩種純的標準物質溶液, 從而得到了5種氮氧同位素豐度的標準溶液(δ15NAir分別為-1.8‰、43.65‰、89.1‰、134.55‰和180‰, δ18OV-SMOW分別為-27.9‰、-14.5‰、-1.1‰、12.3‰和25.7‰)。

2 結果與討論

2.1 建立硝酸鹽氮、氧同位素校準曲線

如圖2和表1所示, 2019年7月28日、8月19日、8月26日不同時間進行的3個批次的細菌反硝化法實驗, 分別對5種不同氮氧同位素豐度的硝酸鹽標準溶液進行了轉化處理和同位素分析測定, 對于每批次內同一豐度樣品設置了5個平行對照組(n= 5), 取其平均值, 然后按照以下公式分別擬合得到了與3批次實驗相對應的氮、氧同位素校準曲線方程：

表1 3個批次硝酸鹽標準物質測試結果及校準方程

圖2 3個批次測定硝酸鹽標準物質氮、氧同位素校準曲線

(1)

(2)

3個批次氮同位素校準曲線方程的斜率均接近理論值1, 相關性系數都在0.999以上, 表明反硝化細菌在將樣品中的硝酸鹽全部還原為N2O的過程中所造成的氮同位素分餾效應很小, 能夠準確反映樣品中硝酸鹽的氮同位素組成。同樣對3個不同時間段所得到的氧同位素校準曲線方程進行對比, 其斜率與理論值1之間存在0.4左右的偏差, 但3次實驗所得到的斜率均穩(wěn)定在0.61～0.63之間, 并且相關性系數也都在0.99以上, 說明該方法在樣品中硝酸鹽轉化為N2O的過程中所造成的氧同位素分餾效應在每個批次間基本一致, 具有較好的穩(wěn)定性, 樣品的測試結果在經過氧同位素校準曲線的校正后, 也能夠準確反映樣品中硝酸鹽的氧同位素組成。對于空白問題, 在每個批次進行標準物質樣品上機測試的同時, 均設置5個空白對照實驗, 即在吹掃完成后不加入任何樣品, 僅在上機之前加入等量的NaOH試劑進行菌種的滅活。實驗結果顯示, 每個批次空白組上機測試所得質量為44的信號峰面積范圍為0.28～0.35, 而標準物質樣品測得的信號峰面積范圍為13.00～15.00, 在此情況下空白相當于樣品量的1.9%～2.3%, 與Sigman等(2001)[18]得到的結論相一致, 判斷在經過2～3 h高純N2吹掃后的菌液中殘留的N2O不會對后續(xù)分析測試造成較大影響。

通過對3個批次所得到的硝酸鹽氮、氧同位素校準曲線進行對比發(fā)現(xiàn), 2019年7月28日、8月19日、8月26日所對應的氮、氧同位素校準曲線的斜率呈現(xiàn)出規(guī)律性遞減, 其中氮同位素校準曲線的斜率由0.990 2先降低為0.985 4，再降低至0.966 6, 而氧同位素校準曲線的斜率則從0.630 2降低為0.629 0，再降低至0.610 3。這可能是設計實驗時為保證實驗條件的相對一致, 3個時間段所選用的反硝化細菌均來自同一平板上的單克隆菌落而忽略了平板上的菌種活性, 該平板在4 ℃的條件下密封保存, 但隨著保存時間的增加該平板上細菌的菌齡不斷升高, 導致其活性持續(xù)下降[30]。活性降低的細菌在將樣品中的硝酸鹽轉化為N2O的過程中所造成的氮、氧同位素分餾效應則逐漸增加, 從而導致對應的氮、氧同位素校準曲線斜率隨時間的增加呈現(xiàn)規(guī)律性遞減。所以, 建議應及時重新活化菌株(每2～3周), 以此來保證反硝化細菌的活性。

2.2 實驗樣品中硝酸鹽氮、氧同位素重現(xiàn)性和準確性分析

表2 3類水樣品中硝酸鹽氮、氧同位素組成

由于本實驗所采用的樣品, 均在-20℃的條件下進行密封冷凍儲存, 隨著樣品保存時間的增加, 可能發(fā)生了硝酸鹽和水之間的氧同位素交換作用, 從而導致海水、湖水和自來水3類水樣品中硝酸鹽的氧同位素的測定結果在不同時間段呈現(xiàn)出了較大差異。所以, 為防止此類情況的發(fā)生, 在樣品采集完成后應在盡可能短的時間內進行分析測試, 從而保證測試數據的準確性。另外值得注意的是, 雖然在兩個月中進行的多次細菌反硝化法實驗所得到的硝酸鹽氮、氧同位素校準曲線的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性都很好, 但考慮到每個批次采用的菌液活性和生長狀態(tài)會存在一些差異[22], 進而導致在硝酸鹽轉化為N2O的過程中所造成的氮、氧同位素分餾效應的程度不同, 所以每個批次進行測定時都應當采用標準溶液來重新建立校準曲線, 從而消除這部分同位素分餾效應所造成的測量誤差。

3 結論

(1)細菌反硝化法在不同時間段所得到的氮同位素校準曲線的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好, 在不同時間段同一樣品中硝酸鹽氮同位素的測定結果基本相同, 說明反硝化細菌將硝酸鹽轉化為N2O的過程中幾乎沒有產生氮同位素分餾效應, 在長時間周期內細菌反硝化法能夠準確測定樣品中硝酸鹽的氮同位素組成。

(2)細菌反硝化法在不同時間段所得到的氧同位素校準曲線的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好, 單個批次內海水、湖水和自來水3類樣品的測定結果也比較穩(wěn)定, 但同一樣品在不同時間段所得到的氧同位素測試結果出現(xiàn)了較大偏差。鑒于氧同位素校準曲線的良好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性, 以及單批次內同一樣品測定結果的一致性, 推測這可能是由于在儲存過程中樣品所含硝酸鹽和水之間發(fā)生了氧同位素的交換作用, 從而導致在不同時間段的測定結果之間存在差異。

(3)本研究通過對2019年7月28日、8月19日、8月26日3個時間段所得到的氮、氧同位素校準曲線方程以及3類水樣品的測試結果進行分析對比, 驗證了細菌反硝化法對海水、湖水和自來水3類水樣品中硝酸鹽氮、氧同位素測定的適用性、重現(xiàn)性和準確性。

(4)考慮到水樣品保存時間和菌種生長狀態(tài)的差異性, 采樣完成后應及時進行分析測定, 并且在每個處理批次內單獨設置標準溶液對測試結果進行校正, 以確保所得數據的準確性。