杜麗娜，蘇燕勝，張武合，吳劍維，陳 鵬

前列腺癌是男性最常見的泌尿生殖系統腫瘤之一，在我國的發(fā)病率和病死率逐年增高[1-2]。然而，前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制目前尚未完全闡明，臨床上仍然缺少持續(xù)有效的治療策略。尋找新的前列腺癌診斷和治療靶點，探索其致病機制，具有重要的科學意義。STYK1（serine threonine tyrosine kinase 1），也稱NOK（novel oncogene with kinase domain），屬于受體型蛋白酪氨酸激酶家族成員，在肺癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的致病過程中發(fā)揮作用，被認為是一種新的癌基因[3-6]。然而，STYK1在前列腺癌中的表達及意義目前仍不完全清楚。為此，本研究通過“UALCAN、GEPIA、LinkedOmics”等數據庫分析STYK1基因在前列腺癌中的表達及生物學功能；收集前列腺癌組織樣本，利用實時定量PCR法研究STYK1基因的表達及與臨床病理特征之間的關系；構建STYK1低表達的前列腺癌細胞系，通過CCK8實驗和流式細胞周期檢測研究STYK1對前列腺癌細胞增殖的影響，以期為前列腺癌的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源 隨機入組2019年1月—2020年8月在空軍986醫(yī)院及西京醫(yī)院行手術切除的前列腺癌標本67例，均經病理科醫(yī)師明確診斷。年齡54～83歲，中位年齡64歲，病例資料完整，取病理前均未進行放化療及內分泌治療。TNM分期依據美國癌癥分期聯合會（AJCC）第8版進行[7]。本研究經空軍軍醫(yī)大學倫理委員會批準同意，入組患者均簽署知情同意書。

1.2 生物信息學分析 利用生物信息學在線工具THE HUMAN PROTEIN ATLAS、UALCAN分析STYK1在前列腺癌中的表達情況；GEPIA分析STYK1與PSA、PSMA、AR、PCA3的表達相關性；利用LinkedOmics進行STYK1基因的功能富集分析。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染 LNCaP細胞購自上?？茖W院細胞庫，在37 ℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）常規(guī)培養(yǎng)。用于干擾STYK1基因表達的shRNA設計及慢病毒包裝由上海吉凱公司完成。為了避免脫靶效應，采用2種針對STYK1基因設計的shRNA進行實驗。shSTYK1#1序列：5' -CCGGGAAGCAGTATGAAGTGATTATCTC GAGATAATCACTTCATACTGCTTCTTTTTTG-3'；shSTYK1#2序列：5'-CCGGGCCCATCTTTCGAGCC AATATCTCGAGATATTGGCTCGAAAGATGGGC TTTTTG-3'。

1.4 實時定量PCR TRIzol法提取總RNA，SuperScript III First-Strand Synthesis kit試劑盒（Invitrogen公司，美國）進行逆轉錄，PCR反應在Funglyn Biotech PCR儀上（Fuang lyn，加拿大）進行，以GAPDH作為內參照。STYK1的引物序列為F：5' - CATCTTTCGAGCCAATATGAACAC-3'，R：5' -TGGAATTGGATTCGCCCTAA-3'。GAPDH的引物序列為F：5' -TGACTTCAACA GCGACACCCA-3'，R：5' -CACCCTGTTGCTGTA GCCAAA-3'。反應條件為：95 ℃預變性10 min，然后按92 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進行40個循環(huán)，72 ℃ 7 min延伸。STYK1基因相對表達量用2-??Ct法進行計算[8-9]。

1.5 Western blot 收取對數生長期細胞后用RIPA緩沖液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。分別取等量（20 μg/孔）的待測樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后電轉至PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃條件下加入STYK1K抗體（1:1 000；ab220262，abcam公司，英國）孵育過夜，之后加入二抗（1:5 000；ZB-2301，中杉金橋公司，中國）室溫下孵育2 h。增強發(fā)光法顯色，ImageJ軟件測量灰度值。目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.6 CCK8繪制生長曲線 每個96孔板中接種100 μl細胞懸液，調整細胞密度至3×103個/孔，每隔24 h取出一塊96孔板，棄上清后加入混合液（CCK-8:RPMI1640=1:10）100 μl，孵育1 h后檢測450 nm處光密度值（OD）。

1.7 流式細胞周期檢測 待測細胞以1×106個/ml的濃度懸浮后，用75%乙醇在4 ?C下固定過夜，冷PBS液洗滌后，加入染色液（50 μg/ml PI和20 μg/ml RNase）在37?C條件下染色30min。使用流式細胞儀（BD Biosciences公司，美國）在488 nm激發(fā)波長下對細胞DNA含量進行分析。

1.8 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以±s表達。2組數據比較采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗，表達率的比較采用Fisher精確檢驗，3組數據間的比較采用one-way ANOVA和Tukey檢驗。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析評價STYK1表達水平對于前列腺癌的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析STYK1在前列腺癌中的表達 通過THE HUMAN PROTEIN ATLAS數據庫分析發(fā)現，STYK1在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中都存在較高水平的表達，其中STYK1在前列腺癌組織中的高表達尤為明顯（圖1A）。通過UALCAN數據庫進一步分析發(fā)現，STYK1基因在前列腺癌組織中的表達具有明顯的種族差異性，其在白種人前列腺癌中的表達水平明顯高于正常前列腺組織（P＜0.05），而在非洲裔美國人中這種差異并不明顯（圖1B）。此外，通過GEPIA數據庫分析發(fā)現，STYK1基因表達水平與前列腺癌發(fā)病中的多種關鍵分子及診斷標志物具有相關性（P＜0.05），如雄激素受體（AR，圖1C），前列腺特異性膜抗原（FOLH1/PSMA，圖1D），前列腺特異性抗原（KLK3/PSA，圖1E），前列腺癌基因3（PCA3，圖1F）。

圖1 生物信息學分析STYK1在前列腺癌中的表達

2.2 實時定量PCR檢測前列腺癌組織中STYK1基因的表達 收集67例在我院行手術治療的前列腺癌患者的臨床資料及手術樣本。利用實時定量PCR檢測STYK1基因在癌組織及癌旁組織中的表達，并計算相對表達量。與癌旁組織比較，STYK1基因在前列腺癌組織中的表達明顯升高（圖2A）（P＜0.05））。以STYK1基因表達水平作為檢驗指標，繪制診斷前列腺癌的ROC曲線(圖2B )，曲線下的面積為0.925（95%CI：0.867～0.964），當截斷值為1.83時，靈敏度為85.07%，特異度為82.09%，約登指數為0.67。進一步對患者進行分組后，發(fā)現TNM（Ⅰ-Ⅱ）期的前列腺癌患者腫瘤組織中STYK1基因表達水平顯著低于TNM（Ⅲ-Ⅳ）的腫瘤患者（圖2C，P＜0.05）。依據術前PSA檢測水平進行分組后，結果顯示PSA＜10 mg/L組的STYK1基因表達水平顯著低于PSA≥10 mg/L組（圖2D，P＜0.05）。根據中位數值將STYK1基因表達水平分為高/低表達組，利用Fisher精確檢驗分析STYK1基因表達與前列腺癌患者臨床病理特征之間的關系。術前PSA≥10 mg/L組中STYK1基因的高表達率顯著高于PSA＜10 mg/L組（70.15% vs 8.96%，P＜0.05），TNM Ⅰ～Ⅱ期組中STYK1基因的高表達率顯著低于TNM Ⅲ～Ⅳ組（25.37% vs 53.73%，P＜0.05），而患者的年齡、Gleason評分高低對STYK1基因表達水平無顯著影響（P＞0.05）（表1）。

表1 STYK1基因表達與前列腺癌臨床病理特征的關系

圖2 STYK1基因在前列腺癌組織中的表達

2.3 前列腺癌中STYK1相關差異基因及功能富集分析 利用LinkedOmics數據庫分析497例前列腺癌樣本中與STYK1相關的差異表現基因（TCGA_PRAD，UNC，RNAseq，Pearson Correlation test）。選取與STYK1表達呈顯著正相關和負相關的前20個基因繪制熱圖，結果顯示，與STYK1呈正相關的基因有CD9、SLC45A3、LPCAT3、LIPH等；呈顯著負相關的基因有SYNGR3、PHC2、SLC2A6等（圖3A）。GO功能富集分析結果顯示，差異基因主要與核苷酸-糖代謝過程、細胞氨基酸代謝過程、脂質分解代謝過程、輔酶代謝過程等功能相關（圖3B），其中涉及多種細胞代謝反應，提示STYK1可能影響前列腺癌細胞的生長和增殖。

圖3 前列腺癌中STYK1相關差異基因及功能富集分析

2.4 STYK1對前列腺癌細胞增殖的影響 通過慢病毒轉染，構建了兩株STYK1穩(wěn)定低表達的LNCaP細胞系。利用實時定量PCR（圖4A）和Western blot檢測（圖4B）證實，在構建的LNCaP-shSTYK1#1和LNCaP-shSTYK1#2細胞中，STYK1的表達均受到了顯著抑制(P＜0.05)。利用CCK8法繪制生長曲線，結果顯示從培養(yǎng)第4天開始，LNCaP-shSTYK1#1和LNCaP-shSTYK1#2細胞的增殖水平顯著低于未轉染的LNCaP細胞（P＜0.05，圖4C）。流式細胞周期檢測的結果顯示，LNCaP-shSTYK1#1和LNCaP-shSTYK1#2細胞的S期細胞比例顯著低于LNCaP細胞（20.67±0.81，21.57±0.80 vs 28.87±0.68，P＜0.05）（圖4D）。

圖4 抑制STYK1基因表達對LNCaP細胞增殖的影響

3 討論

由于STYK1基因在前列腺癌中的表達及作用尚不清楚，因此本研究首先對STYK1的表達水平進行了生物信息學分析。分析結果顯示，STYK1在前列腺癌中呈現較高的表達水平，甚至高于肺癌、乳腺癌、胰腺癌等其他類型的腫瘤，而STYK1在肺癌、乳腺癌等腫瘤發(fā)病中的作用已被廣泛報道[5，10-11]。進一步分析還發(fā)現，在前列腺癌中，STYK1基因的表達與AR、PSA、PSMA、PCA3等基因的表達之間存在顯著的相關性。AR是前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要驅動因素，也是一種常用的治療靶點[12-13]。PSA、PSMA、PCA3則是前列腺癌的特征性蛋白，在前列腺癌中特異性高表達，是目前常用的前列腺癌診斷標志物[14-16]。這些結果都提示STYK1可能在前列腺癌的發(fā)病中發(fā)揮作用。此外，生物信息學的分析結果還提示，STYK1的表達具有種族差異性。白種人前列腺癌組織中STYK1的表達水平顯著高于正常前列腺組織，而在非洲裔美國人中則未發(fā)現這種差異性表達。這也從側面說明了研究亞裔人群前列腺癌中STYK1表達及作用的必要性。

利用實時定量PCR的方法，檢測了67例在我院行手術治療的前列腺癌患者中STYK1基因的表達情況，證實STYK1基因在前列腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，而且STYK1表達水平和患者的TNM分期、術前PSA水平等臨床病理特征之間存在關聯。ROC曲線結果顯示STYK1基因的表達水平對于前列腺癌具有顯著的診斷意義，這與之前的生物信息學分析結果（STYK1和PSA/PSMA/PCA3的表達具有相關性）一致。STYK1在前列腺癌中的特異性高表達說明其可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。為此，本研究利用LinkedOmics數據庫進行了功能富集分析，發(fā)現STYK1相關的差異表現基因涉及了多個細胞代謝信號通路，提示STYK1可能影響前列腺癌細胞的增殖過程。

為了證實STYK1基因在前列腺癌細胞增殖中的作用，利用慢病毒轉染構建了STYK1低表達的前列腺癌細胞系。通過CCK8法繪制生長曲線和流式細胞周期檢測，發(fā)現抑制STYK1基因表達后，前列腺癌細胞的增殖能力也受到了明顯的抑制。已有研究證實，STYK1作為一種蛋白酪氨酸激酶，能夠影響PI3K、AKT等多種下游信號分子的活性，而后者在腫瘤細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。這與本研究結果一致，都提示STYK1可能通過影響腫瘤細胞增殖來參與前列腺癌的發(fā)病過程。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析和臨床樣本檢測，證實STYK1基因在前列腺癌中特異性高表達，表達水平與TNM分期等臨床要素相關，且具有潛在的診斷價值，細胞功能學實驗進一步證實STYK1能夠影響前列腺癌細胞的增殖能力。這些結果提示STYK1有望成為新的前列腺癌診療靶點。