翁宇航，楊永峰

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院)肝病科，南京 210003

ABCB4(ATPbinding cassette, sub-family B, member 4)基因位于染色體7q21.1，包含28個(gè)基因片段，編碼27個(gè)外顯子，大小為74 kb。ABCB4基因編碼蛋白MDR3，該蛋白表達(dá)于肝細(xì)胞的毛細(xì)膽管膜上，起磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。當(dāng)ABCB4發(fā)生突變影響MDR3功能時(shí)，輕者會(huì)導(dǎo)致膽管損傷、膽石癥等；重者可向門(mén)靜脈高壓、肝硬化以及晚期肝病方向發(fā)展。本文就ABCB4基因型與表型相關(guān)性作一綜述。

1 ABCB4蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

ABCB4基因編碼MDR3蛋白，它是一種P糖蛋白，含有ATP結(jié)合位點(diǎn)，是一種ATP依賴(lài)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)將磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管內(nèi)[1]。在結(jié)構(gòu)上，MDR3是由兩個(gè)胞質(zhì)核苷酸結(jié)合域(nucleotide binding domain，NBD)和兩個(gè)跨膜區(qū)(transmembrane domain，TMD)組成。NBD是大結(jié)構(gòu)域，包含與ATP結(jié)合的高度保守序列，如Walker A和B序列，以及A、D、H和Q環(huán)，其中Q環(huán)和H環(huán)對(duì)ATP水解至關(guān)重要。MDR3的主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是兩個(gè)TMD與ATP一起構(gòu)成功能單元實(shí)現(xiàn)逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)，期間所需能量都由NBD的ATP水解提供[2]。因此，當(dāng)ATP轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被破壞時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)功能會(huì)受到顯著影響。

在生理情況下，膽汁內(nèi)主要含有幾種有形成分：磷脂酰膽堿、膽固醇、膽鹽、膽紅素、無(wú)機(jī)鹽。當(dāng)磷脂與膽鹽的比例在(2～3)∶1時(shí)，膽固醇達(dá)到最大溶解，這有利于膽管的通暢。而在病理狀態(tài)下，任何影響MDR3功能的因素存在時(shí)，磷脂都無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)到毛細(xì)膽管中。磷脂酰膽堿和膽鹽的比例失衡，膽固醇因溶解度降低易析出，造成毛細(xì)膽管的堵塞；另外，膽鹽有很強(qiáng)的去垢性，沒(méi)有磷脂中和時(shí)，會(huì)對(duì)毛細(xì)膽管產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性，造成毛細(xì)膽管壁的損傷[3]。

2 ABCB4疾病譜與突變

ABCB4突變涉及的疾病譜包括妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP)、藥物性肝損傷(DILI)、低磷脂相關(guān)膽石癥綜合征(low-phospholipid associated cholelithiasis, LPAC)和進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥3型(progressive familial intrahepatic cholestasis type 3, PFIC3)等[4-5]。

相關(guān)疾病的產(chǎn)生主要是由于MDR3蛋白質(zhì)表達(dá)、穩(wěn)定性或活性改變。有學(xué)者在2016年提出了ABCB4突變的分類(lèi)(表1)：(1)引起MDR3嚴(yán)重功能障礙的突變，包括無(wú)義突變(如p.Arg144Stop[6])、移碼突變(如p.I587DfsX603[7])、缺失突變(如p.F529del[8])，此類(lèi)突變會(huì)引起MDR3氨基酸鏈的明顯異常，從而顯著影響其蛋白結(jié)構(gòu)和功能；(2)引起MDR3蛋白成熟障礙的突變，如c.1621A> T(p.I541F)、c.1667T>G(p.L556R)等突變，此類(lèi)突變導(dǎo)致前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留、成熟障礙，MDR3無(wú)法定位到毛細(xì)膽管膜上，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)功能；(3)影響MDR3活性的突變，如c.1037G>T(p.S346l)、c.2177C>T(p.P726L)等，此類(lèi)突變的轉(zhuǎn)運(yùn)體雖然可以定位到毛細(xì)膽管膜，但其活性降低，同樣影響磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)，目前發(fā)現(xiàn)的大部分突變體都屬于這一類(lèi)；(4)影響MDR3穩(wěn)定性的突變，如c.1270A>G(p.T424A)、c.1529A>G(p.N510S)等，突變可能不是ATP結(jié)合或水解的關(guān)鍵序列，但會(huì)改變分子整體結(jié)構(gòu)，使其更容易降解；(5)尚未明確意義的突變，如c.523A>G(p.T175A)、c.1954A>G(p.R652G)，此類(lèi)突變目前影響還未知，可能與其他缺陷基因相關(guān)聯(lián)時(shí)可以顯示出效應(yīng)[9]。

表1 ABCB4突變功能分類(lèi)及治療

針對(duì)不同突變類(lèi)型有不同的治療方法。熊去氧膽酸(UDCA)親水，肝毒性小，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗凋亡作用，是ABCB4缺乏癥患者的一線(xiàn)治療藥物，可用于A(yíng)BCB4各型突變的患者。ABCB4某些突變表型可能導(dǎo)致嚴(yán)重臨床后果(如PFIC3或失代償性膽汁性肝硬化)，使探索新的治療方案成為必要。最近，已有不少分子伴侶藥物顯示出其治療效果。ABCB4致病的Ⅱ類(lèi)突變，可以用具有伴侶活性的化合物(環(huán)孢菌素A、4-苯基丁酸酯，姜黃素)治療[10]；在另一項(xiàng)研究[11]中，針對(duì)Ⅲ類(lèi)突變，囊性纖維化電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)依伐卡托可用于治療CFTR基因(也是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)特定門(mén)控變異患者，患者用藥后磷脂酰膽堿分泌增加，這為治療的早期工作奠定了基礎(chǔ)；此外，核膜受體激動(dòng)劑(例如他汀類(lèi)藥物、貝特類(lèi)、乙酰膽酸)也可用于Ⅲ、Ⅳ類(lèi)突變的患者，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解抑制劑(MG132)也可以增加功能蛋白的表達(dá)。

3 ABCB4相關(guān)疾病的臨床表型

3.1 ICP的臨床表型 ICP是妊娠時(shí)期的膽汁淤積性疾病。最早由Ahlfeld在1883年提出，它通常出現(xiàn)于妊娠中晚期，是一種良性疾病[12]?；颊叱３?huì)出現(xiàn)血清膽汁酸濃度升高，一般在產(chǎn)后12周消失。當(dāng)孕婦血清膽汁酸濃度>40 μmol/L時(shí),預(yù)后多不佳，妊娠結(jié)局包括自發(fā)早產(chǎn)和晚期妊娠[13]。ABCB4突變與ICP有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，致ICP的突變多為致病性輕的雜合突變。1999年，Jacquemin等[7]報(bào)告了一個(gè)大型家系，認(rèn)為ABCB4突變與ICP相關(guān)聯(lián)。先證者(患者Ⅳ 6)患有PFIC(c.1712delT)，測(cè)序結(jié)果提示為ABCB4純合突變，其母親患有ICP，同時(shí)攜帶ABCB4雜合突變，其父親僅為ABCB4雜合突變。在這個(gè)家庭其他親屬中，還有5名婦女患有ICP，這是第一次發(fā)現(xiàn)ABCB4與ICP相關(guān)聯(lián)。針對(duì)ABCB4缺陷或因其他原因患有ICP的孕婦，應(yīng)定期隨訪(fǎng)并遺傳咨詢(xún)，因?yàn)镮CP也可能產(chǎn)生不良預(yù)后。有報(bào)道[14]稱(chēng)，ICP患者并發(fā)膽結(jié)石、肝硬化、肝細(xì)胞癌、自身免疫性疾病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。

3.2 DILI的臨床表型 藥物等外源物質(zhì)也可抑制ABCB4/MDR3功能，引起DILI。2014年Zollner等[15]應(yīng)用免疫組化檢測(cè)了23例膽汁淤積性DILI患者的MDR3表達(dá)水平，其中有19例MDR3表達(dá)降低，此類(lèi)表達(dá)降低患者之前用藥史包括克拉維酸(7例)、阿莫西林(5例)、雙氯芬酸(2例)、利福平(1例)等，可見(jiàn)DILI與ABCB4有較強(qiáng)的相關(guān)性。考慮到本研究樣本量較少，其藥物種類(lèi)關(guān)聯(lián)性在今后研究中也許可以進(jìn)一步被揭示出來(lái)。另有多條證據(jù)也提示ABCB4 缺陷易導(dǎo)致膽汁淤積性藥物性肝炎[16]。因此，ABCB4突變使DILI的發(fā)生具有遺傳易感性。然而，在大多數(shù)膽汁淤積性DILI病例中，ABCB4的表達(dá)也受其他基礎(chǔ)疾病的嚴(yán)重干擾，目前尚不清楚是否僅由ABCB4突變所致[17]。

3.3 LPAC的臨床表型 LPAC最早由Rosmorduc等[18]提出，特征是膽石癥反復(fù)發(fā)作，發(fā)病患者多為40歲以?xún)?nèi)的年輕人，其發(fā)病與ABCB4基因突變有關(guān)。臨床上出現(xiàn)如下兩種以上情況時(shí)，應(yīng)考慮診斷：40歲前出現(xiàn)癥狀；膽囊切除術(shù)后膽道癥狀復(fù)發(fā)；超聲提示肝臟內(nèi)存在回聲灶、肝內(nèi)結(jié)石；患者既往有ICP病史；一級(jí)親屬有膽石癥的家族史[19]。LPAC與ABCB4突變有明顯的相關(guān)性。2013年P(guān)oupon等[20]做了一項(xiàng)LPAC基因型與表型相關(guān)性的研究，研究納入了156例確診為L(zhǎng)PAC患者，其中79例檢測(cè)出ABCB4突變(61個(gè)錯(cuò)義突變和18個(gè)截?cái)嗤蛔?，70%突變患者是女性，且52%的患者伴有ICP。在錯(cuò)義突變中，52例患者表現(xiàn)為雜合突變，可見(jiàn)大部分LPAC表型患者存在A(yíng)BCB4突變，突變類(lèi)型以雜合突變多見(jiàn)，女性多發(fā)，且可能與ICP相關(guān)。

3.4 PFIC3的臨床表型 目前發(fā)現(xiàn)的PFIC共有6型，其中1～3型相對(duì)常見(jiàn)。PFIC1和PFIC2患者在嬰兒期甚至在新生兒期就有癥狀；PFIC3發(fā)病年齡可發(fā)生在嬰兒后期(約1/3的病例)，甚至是青春期[21]，為常染色體隱性遺傳病，是ABCB4基因突變引起。PFIC3型患者瘙癢通常沒(méi)有PFIC1或PFIC2嚴(yán)重，其并發(fā)癥主要包括肝硬化、門(mén)靜脈高壓癥、胃腸道出血，這些通常為大齡兒童和年輕人的首發(fā)癥狀，在出生后10年、20年可從伴或不伴黃疸的慢性膽汁淤積發(fā)展為門(mén)靜脈高壓和終末期肝病。PFIC3相對(duì)于其他ABCB4相關(guān)疾病類(lèi)型也較為嚴(yán)重，突變類(lèi)型多為復(fù)合雜合突變和純合突變，致病性較強(qiáng)，患者早年就有肝功能異常，并在短期內(nèi)向肝硬化、肝衰竭進(jìn)展[22-25]。2018年Schatz等[26]回顧性收集了38例ABCB4純合、雜合突變患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室資料。其中雜合突變的患者有7例，均未行肝移植手術(shù)，占比為0；復(fù)合雜合突變患者有15例，其中6例在早年行肝移植手術(shù)，占比為40%；純合突變患者有16例，其中10例在早年行肝移植手術(shù)，占比為62.5%。由此可見(jiàn)雜合突變致病性較弱，復(fù)合雜合、純合突變致病性較強(qiáng)。

4 ABCB4基因型與表型相關(guān)性

ABCB4基因突變引起臨床表型的輕重，與突變位置、突變功能分類(lèi)、突變對(duì)MDR3功能影響程度、突變的雜合或純合性相關(guān)；致病性較弱、雜合的突變引起輕的臨床表型(ICP、DILI、LPAC)，致病性強(qiáng)、純合或復(fù)合雜合的突變引起重的臨床表型(PFIC3)。

根據(jù)ABCB4常見(jiàn)突變位點(diǎn)，結(jié)合疾病的臨床表型，整理如表2。

表2 ABCB4相關(guān)疾病臨床表型及突變

4.1 ABCB4突變位置與致病性相關(guān) ABCB4轉(zhuǎn)運(yùn)體主要是由2個(gè)NBD和2個(gè)TMD構(gòu)成。2016年Delaunay等[9]ABCB4的功能突變分類(lèi)臨床隊(duì)列研究中，共納入9例PFIC3患者，發(fā)現(xiàn)位于關(guān)鍵位置的突變均有較強(qiáng)的致病性，如c.1621A>T(p.I541F)突變位于A(yíng)BCB4轉(zhuǎn)運(yùn)體的第一個(gè)NBD中，位于Walker B、the signature序列之間，該突變患者1歲時(shí)就出現(xiàn)癥狀，臨床表現(xiàn)為黃疸、瘙癢、肝腫大、門(mén)靜脈高壓，在5年內(nèi)接受了肝移植；而位于TMD區(qū)域的突變也有類(lèi)似情況，c.1037G>T(p.S346l)突變位于第六(TM6)跨膜節(jié)段的中間，患者在出生后3個(gè)月出現(xiàn)黃疸、瘙癢、肝腫大及門(mén)靜脈高壓，10歲時(shí)接受了肝移植。2006年，Dawson等[27]對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sav1866的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)研究表明，ABC蛋白的NBD含有一個(gè)保守的X環(huán)基序，該基序?qū)TP結(jié)合和水解的構(gòu)象變化傳遞給TMD的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。因此，NBD與TMD序列突變導(dǎo)致的保守區(qū)域及氨基酸疏水性和電荷變化，都有可能影響ATP轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。從能量的觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，這些變化會(huì)產(chǎn)生不利的影響。由此可見(jiàn)，任何影響關(guān)鍵序列的突變都可能導(dǎo)致磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)障礙從而致病。

4.2 ABCB4突變的功能分類(lèi)與致病性相關(guān) 本文第二部分已經(jīng)闡述了ABCB4突變的功能分類(lèi)，各型突變從機(jī)制上說(shuō)都可能引起疾病。2015年，Gordo-Gilart等[28]根據(jù)ABCB4突變功能分類(lèi)做了一項(xiàng)關(guān)于PFIC3臨床轉(zhuǎn)歸與MDR3活性的研究，對(duì)6例PFIC3患兒進(jìn)行ABCB4外顯子(含邊界內(nèi)含子)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，編號(hào)1患者攜帶c.3633+2 T>A突變，分類(lèi)上屬于Ⅰ類(lèi)突變，該患者肝穿刺病理表現(xiàn)為橋接性纖維化，在5歲時(shí)行肝移植手術(shù)；編號(hào)2和編號(hào)3患者攜帶c.202G>A(p.G68R)突變，編號(hào)4患者攜帶c.1436C>T(p.P479L)突變，熒光共聚焦定位都提示MDR3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留，分類(lèi)上屬于Ⅱ類(lèi)突變，患者2、3分別在第6、7年行肝移植術(shù)，患者4在同年也被列入肝移植候補(bǔ)名單。編號(hào)5、6患者則分別攜帶c.602C>T(p.T201M)、c.3352G>A(p.E1118K)、c.2932T>C(p.S978P)突變，免疫熒光提示MDR3表達(dá)位置與野生型一致，都位于毛細(xì)膽管膜，分類(lèi)上屬于Ⅲ、Ⅳ類(lèi)突變，患者皆未行肝移植手術(shù)，目前使用UDCA治療。在生理情況下，蛋白質(zhì)合成需要先在細(xì)胞核內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄，后RNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，在核糖體翻譯形成前體蛋白，隨后經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體加工成熟，最后轉(zhuǎn)運(yùn)至相應(yīng)位點(diǎn)行使功能。Ⅰ類(lèi)突變?yōu)闊o(wú)義突變、移碼突變、缺失突變，突變發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，它可能導(dǎo)致過(guò)早引入終止密碼子或mRNA不穩(wěn)定和及衰變，此類(lèi)突變會(huì)嚴(yán)重影響突變下游序列，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響很大，往往連前體蛋白也無(wú)法形成，致病性最為嚴(yán)重。Ⅱ類(lèi)突變會(huì)導(dǎo)致MDR3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留，此類(lèi)突變前體蛋白已經(jīng)形成，但不能或僅少部分可以定位到毛細(xì)膽管膜行使轉(zhuǎn)運(yùn)功能，致病性相比Ⅰ類(lèi)突變較輕。Ⅲ、Ⅴ類(lèi)突變MDR3可以定位到毛細(xì)膽管膜，僅影響穩(wěn)定性或活性，故致病性相比Ⅰ、Ⅱ類(lèi)突變更輕。Ⅴ類(lèi)突變多為基因多態(tài)性，影響很小。

4.3 ABCB4突變對(duì)MDR3功能影響程度與致病性相關(guān) 2016年，Gordo-Gilart等[29]研究了9例膽汁淤積性肝病患兒的ABCB4雜合子突變。1例c.682G>C(p.G228R)突變的男性患者，MDR3活性約為野生型的50%，他在9歲時(shí)出現(xiàn)皮膚瘙癢、肝腫大及晚期肝臟疾病的體征，使用UDCA后瘙癢有所緩解，在14歲時(shí)，患者出現(xiàn)了門(mén)靜脈高壓并進(jìn)行了肝移植；而入組的另1例c.959C>T(p.S320F)突變的女性患者，MDR3活性約為野生型的78%，她在2歲時(shí)出現(xiàn)皮膚瘙癢、肝腫大、無(wú)黃疸，在13歲之后肝功能一直保持正常。在體外實(shí)驗(yàn)中，G228R突變使MDR3滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而毛細(xì)膽管膜表達(dá)缺失，失去了磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)功能。MDR3突變體S320F正常表達(dá)于毛細(xì)膽管膜，但其MDR3功能下降約為正常的25%，可能只是影響了MDR3的穩(wěn)定性或活性，而對(duì)于定位無(wú)影響，所以對(duì)于磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)影響較小，MDR3活性仍部分保留。實(shí)驗(yàn)提示了MDR3錯(cuò)誤定位或功能障礙的程度與患者的臨床表型有一定相關(guān)性。

4.4 ABCB4突變的雜合、純合性也與致病性相關(guān) 2021年Avena等[30]做了一項(xiàng)關(guān)于成人膽汁淤積癥患者ABCB4突變的研究，共納入19例不明原因肝病患者，在血中提取基因組DNA。擴(kuò)增所有編碼區(qū)和外顯子邊界內(nèi)含子，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序。隊(duì)列中患者A.Ⅱ.3、A.Ⅱ.4均為c.2211G>A突變，臨床檢查時(shí)未發(fā)現(xiàn)肝臟疾病，也沒(méi)有肝硬化，生化指標(biāo)僅表現(xiàn)為ALP 輕度升高；患者A.Ⅰ.3是1例攜帶c.2211G>A和c.959C>T的患者，他在34歲時(shí)被診斷，隨后發(fā)展為膽石癥、肝硬化，在沒(méi)有使用UDCA治療時(shí)GGT 1488 U/L、ALP 946 U/L、ALT 195 U/L，這表明復(fù)合雜合的累加效應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的表型。Gordo-Gilart等[10]的研究也證明了這點(diǎn)，雜合突變患者c.523A>G(p.T175A)的臨床疾病嚴(yán)重程度遠(yuǎn)低于純合突變的患者c.1621A>T(p.I541F)。因而雜合突變致病性較弱，復(fù)合雜合及純合突變致病性較強(qiáng)。

5 小結(jié)與展望

盡管PFIC3為罕見(jiàn)病，但是ABCB4突變引起的其他臨床表型(ICP、LPAC、DILI)并不罕見(jiàn)。臨床工作中不明原因慢性膽汁淤積要考慮ABCB4突變相關(guān)疾病，需更為詳細(xì)地詢(xún)問(wèn)病史，尤其需要追問(wèn)家族史，同時(shí)關(guān)注患者的臨床表現(xiàn)及病程進(jìn)展，排除相似診斷，在檢查時(shí)完善實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)檢測(cè)，必要時(shí)行肝穿刺活檢及基因檢查。該病尚缺乏特異性診斷，確診仍需依靠基因檢測(cè)。因此，臨床醫(yī)生需要增加對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，遇到不明原因慢性膽汁淤積癥時(shí)需要考慮到該病。未來(lái)還需要大量基礎(chǔ)與臨床相結(jié)合的研究來(lái)闡明該病的相關(guān)機(jī)制，在臨床實(shí)踐中建立起更準(zhǔn)確的基因型表型關(guān)聯(lián)，合理評(píng)估ABCB4突變的位點(diǎn)、突變類(lèi)型、對(duì)MDR3功能影響程度、純合雜合情況，以便為后期提供更好的個(gè)體化治療。目前，ABCB4嚴(yán)重表型(如PFIC3)患者的治療往往選擇有限，除了用UDCA、利福平等進(jìn)行藥物治療外，原位肝移植仍是終末期肝病的唯一治療方法，因此尋找新的治療方法和治療干預(yù)的分子靶標(biāo)是非常有意義的。另外，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于該病的研究也較少，國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的致病突變位點(diǎn)與國(guó)外也有所不同，尋找符合我國(guó)的常見(jiàn)突變位點(diǎn)在未來(lái)將尤為迫切。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：翁宇航負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫(xiě)論文；楊永峰負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章，修改論文并最后定稿。