張 杰，馬學(xué)峰，王藝奮，王孟軻，莊立琨，劉守勝，辛永寧,3

1 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院 感染性疾病科，山東 青島 266011；2 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院臨床研究中心，山東 青島 266071；3 青島市消化疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1-2]，目前已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的慢性肝臟疾病[3]。系統(tǒng)研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制對(duì)于其防治至關(guān)重要。NAFLD是一種由遺傳、飲食和腸道微生態(tài)等多種因素共同作用的復(fù)雜疾病[4-5]，近年來遺傳因素在NAFLD發(fā)病中的作用引起越來越多重視。Kozlitina等[6]發(fā)表的一項(xiàng)外顯子組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白超家族6成員2基因(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)編碼蛋白的E167K多態(tài)性在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。TM6SF2屬于跨膜蛋白超家族成員，主要在肝臟、小腸、腎臟等器官高表達(dá)。隨后的人群試驗(yàn)[7-9]也進(jìn)一步證實(shí)TM6SF2 E167K多態(tài)性是NAFLD的一個(gè)致病風(fēng)險(xiǎn)因子。

本研究構(gòu)建了TM6SF2肝細(xì)胞特異性敲除(TM6SF2-HKO)小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO小鼠的肝質(zhì)量、肝指數(shù)、ALT、胰島素水平及肝臟TG水平均高于對(duì)照組小鼠，證明了肝細(xì)胞敲除TM6SF2可加重高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和肝損傷，為研究TM6SF2在NAFLD中的長(zhǎng)期作用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 肝組織特異表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因(Alb-Cre)小鼠由張令強(qiáng)教授(北京軍事醫(yī)學(xué)研究院)贈(zèng)送。8周齡雄性TM6SF2-HKO小鼠和對(duì)照小鼠(TM6SF2-Flox)(各4只/組)給予高脂飲食(60%脂肪)16周建立NAFLD模型，TM6SF2-HKO小鼠和TM6SF2-Flox小鼠(各8只/組)給予普通飲食16周作為對(duì)照。所有小鼠維持12 h明/暗周期并自由攝入食物和飲用水。建模完成，小鼠禁食6 h后給予安樂死。

1.2 嵌合體F0代陽(yáng)性小鼠的獲得 通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建TM6SF2基因條件性敲除小鼠模型。構(gòu)建針對(duì)小鼠TM6SF2基因的sgRNA、Cas9 mRNA和攜帶LoxP片段的donor載體。利用TM6SF2特異性sgRNA指導(dǎo)Cas9核酸酶在內(nèi)含子2和內(nèi)含子3中剪切DNA雙鏈，通過同源重組修復(fù)將LoxP序列整合到兩位點(diǎn)。將sgRNA、Cas9 mRNA和donor載體共同注入雌鼠受精卵中，將受精卵植入到假孕的小鼠子宮中。所得子代通過PCR鑒定基因型，挑選出F0代陽(yáng)性小鼠。雄性F0代小鼠與野生雌鼠交配，獲得F1代嵌合體小鼠。

1.3 小鼠基因型鑒定的方法 剪取小鼠尾尖于離心管中，加入70 μl裂解液A液(25 mmol/L NaOH，20 μmol/L EDTA)，95 ℃金屬浴45 min后，加入70 μl的裂解液B液(40 mmol/L Tris-Cl)，充分研磨組織，離心所得上清液即為基因組DNA，以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶判斷其基因型。

表1 基因型鑒定對(duì)應(yīng)的引物序列

1.4 RNA提取和定量(q)RT-PCR分析 使用RNAiso(Takara，日本)從各組織中提取總RNA，使用PrimeScriptTM試劑盒(Takara，日本)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen，德國(guó))以β-Actin為內(nèi)參定量TM6SF2基因在各組織的表達(dá)量。用到以下引物，TM6SF2：5′-CGGACTGGGCCTTGGTATTT-3′，5′-CTTGGTCCTGTGGCGAAGAT-3′；β-Actin：5′-CAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3′，5′-CACGATGGAGGGAATACAG-3′。

1.5 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT) 小鼠禁食6 h后，測(cè)量小鼠尾靜脈血糖。按照2 mg/kg的劑量給予小鼠灌胃葡萄糖[10]，記錄小鼠灌胃后30 min、60 min和120 min時(shí)間點(diǎn)的血糖值。

1.6 小鼠血液相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 小鼠禁食后，按照0.01 mL/g的劑量腹腔注射4%水合氯醛，麻醉后取其靜脈血，根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))所述方法檢測(cè)血漿中AST、ALT、TG、TC及胰島素水平。

1.7 小鼠肝臟TG檢測(cè) 稱量10 mg小鼠肝組織，加入90 μL無(wú)水乙醇，充分研磨組織，離心后取上清液，使用TG檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))檢測(cè)肝臟TG水平。

1.8 倫理學(xué)審查 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)原則進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2018-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(魯)2020 0009，倫理審批編號(hào)：AHQU-MAL20180504。

2 結(jié)果

2.1 TM6SF2-HKO小鼠的獲得與鑒定 為探究TM6SF2在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了TM6SF2條件性敲除小鼠，構(gòu)建策略如圖1所示。按Cre/LoxP繁殖策略，獲得的子代小鼠通過PCR鑒定其基因型(圖2)。提取TM6SF2-HKO小鼠和TM6SF2-Flox小鼠肝臟以及心、腎、小腸等組織RNA，發(fā)現(xiàn)除肝臟外(t=5.823,P=0.028)，其他組織TM6SF2表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，證明在TM6SF2-HKO 小鼠中，TM6SF2在肝細(xì)胞特異性敲除(圖3)。

圖1 TM6SF2-CKO小鼠構(gòu)建策略

注：a,TM6SF2fl/fl鑒定,電泳僅有一條332 bp條帶，則為TM6SF2fl/fl純合小鼠；僅有一條239 bp條帶，則為TM6SF2-/-野生小鼠；若兩條帶都存在，則為TM6SF2fl/-雜合小鼠。b,Alb-Cre鑒定，若有一條279 bp條帶，則為Cre轉(zhuǎn)基小鼠。因此，42號(hào)為TM6SF2-HKO小鼠(TM6SF2fl/fl Alb-Cre)，45號(hào)為TM6SF2-Flox小鼠(TM6SF2fl/fl)。

圖3 TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox小鼠各組織TM6SF2表達(dá)水平

2.2 高脂飲食下TM6SF2-HKO可增加小鼠肝指數(shù)及ALT水平 TM6SF2-HKO小鼠構(gòu)建成功后，給予兩組小鼠高脂飲食以探究其一般情況差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通飲食及高脂飲食下，TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。高脂飲食時(shí)，TM6SF2-HKO組小鼠肝質(zhì)量、肝指數(shù)高于TM6SF2-Flox組(P值均<0.01)，而普通飲食時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。檢測(cè)血漿中與肝損傷相關(guān)的ALT和AST水平，發(fā)現(xiàn)給予高脂飲食時(shí)，TM6SF2-HKO組血漿ALT水平較TM6SF2-Flox組升高(P<0.01)，AST水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 TM6SF2-HKO對(duì)小鼠肝質(zhì)量、肝酶等指標(biāo)影響

2.3 TM6SF2-HKO促進(jìn)血漿胰島素水平升高 肝臟對(duì)于調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)起重要作用，檢測(cè)糖代謝相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在普通飲食和高脂飲食的條件下，TM6SF2-HKO和TM6SF2-Flox組空腹血糖無(wú)差異(P值均>0.05)，TM6SF2-HKO組血漿胰島素水平較TM6SF2-Flox組升高(P值均<0.05)。給予小鼠灌胃葡萄糖，發(fā)現(xiàn)在30、60和120 min時(shí)，兩組小鼠血糖及OGTT對(duì)應(yīng)曲線下面積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，胰島素抵抗指數(shù)差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 肝細(xì)胞TM6SF2缺失對(duì)小鼠糖代謝影響

2.4 高脂飲食下TM6SF2-HKO可加重肝臟脂肪變性 進(jìn)一步檢測(cè)脂代謝相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在普通飲食和高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO組和TM6SF2-Flox組之間血漿TC、TG水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。高脂飲食時(shí)，TM6SF2-HKO小鼠肝組織TG水平高于TM6SF2-Flox小鼠(P<0.05)(表4)。HE染色發(fā)現(xiàn)TM6SF2-HKO組脂滴數(shù)量和大小高于TM6SF2-Flox組(圖4)。油紅O染色結(jié)果表明，高脂飲食增加了肝臟紅染面積，TM6SF2-HKO組紅染面積高于TM6SF2-Flox組(圖5)。

注：a，TM6SF2-Flox-CD；b，TM6SF2-HKO-CD；c，TM6SF2-Flox-HFD；d，TM6SF2-HKO-HFD。

注：a，TM6SF2-Flox-CD；b，TM6SF2-HKO-CD；c，TM6SF2-Flox-HFD；d，TM6SF2-HKO-HFD。

表4 TM6SF2-HKO對(duì)小鼠脂代謝影響

3 討論

全身敲除小鼠模型可導(dǎo)致全部體細(xì)胞內(nèi)靶基因缺失，可能存在胚胎發(fā)育異常、純合致死等問題，而條件性敲除小鼠模型可以特異性敲除某個(gè)特定組織或器官中的靶基因，以研究該基因在特定組織或器官中的作用[11]。Fan等[12]通過TM6SF2全身敲除的小鼠模型、肝臟特異性過表達(dá)人源TM6SF2基因的小鼠模型，Kozlitina等[6]利用腺病毒特異性敲低肝細(xì)胞TM6SF2的小鼠模型探究TM6SF2在NAFLD中的作用，但其在肝臟的生理功能并未達(dá)成共識(shí)。CRISPR/Cas9技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、高效的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為靶向基因組編輯的主要工具[13]，被應(yīng)用于動(dòng)物模型的構(gòu)建等方面[14]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定的TM6SF2-HKO小鼠模型，以研究肝臟TM6SF2在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用。

血清ALT、AST水平升高被認(rèn)為是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[15-16]。本研究中高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO小鼠血漿ALT水平高于TM6SF2-Flox小鼠，表明敲除肝臟TM6SF2在高脂喂養(yǎng)時(shí)可加重小鼠肝損傷。血漿AST水平無(wú)差異，可能是由于ALT反映早期肝細(xì)胞損傷，而AST反映較嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷[15,17]，肝臟病理學(xué)同樣證明在高脂飲食條件下，TM6SF2-HKO加重了肝細(xì)胞損傷程度。肝臟產(chǎn)生的葡萄糖約占內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)量的90%，這對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[18]，NAFLD與胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)[19]。檢測(cè)肝臟TM6SF2對(duì)糖代謝的影響，發(fā)現(xiàn)在普通飲食和高脂飲食下，TM6SF2-HKO小鼠胰島素水平較對(duì)照組升高，并可能導(dǎo)致了本研究觀察到的其血糖水平稍低于對(duì)照組，提示肝臟敲除TM6SF2后可能通過改變胰島素水平進(jìn)而調(diào)節(jié)糖代謝。

NAFLD以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積為主要特征，可導(dǎo)致肝質(zhì)量、肝指數(shù)等指標(biāo)改變。本研究中喂養(yǎng)TM6SF2-HKO小鼠高脂飲食16周，小鼠肝質(zhì)量、肝指數(shù)和肝臟TG水平均較對(duì)照組升高，表明肝臟特異性敲除TM6SF2可促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性，TM6SF2的表達(dá)水平是代謝穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要決定因素。已發(fā)表的TM6SF2全身敲除小鼠模型中，高脂飲食喂養(yǎng)12周后小鼠肝指數(shù)無(wú)變化[12]，推測(cè)可能是由于本研究為肝細(xì)胞特異性敲除或全身敲除模型中高脂喂養(yǎng)僅12周而脂肪變性程度低所致。本研究中TM6SF2-HKO小鼠血漿TC水平較對(duì)照組無(wú)差異，而全身敲除小鼠的血漿TC水平較對(duì)照組下降[9]?？赡苁怯捎赥M6SF2不僅在肝臟中高表達(dá)，在小腸中也高表達(dá)，小腸參與了部分TC合成過程，導(dǎo)致TM6SF2-HKO模型和全身敲除模型結(jié)果不一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食條件下，兩組小鼠血漿TG水平降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，肝臟中TG水平升高。這與腺相關(guān)病毒敲低肝臟TM6SF2小鼠表型基本一致[6]。根據(jù)肝臟敲除TM6SF2對(duì)TG的影響，筆者推測(cè)肝臟敲除TM6SF2可能導(dǎo)致血漿TG更多的轉(zhuǎn)化為肝臟TG，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積增加。相較CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/LoxP策略，腺相關(guān)病毒敲低基因雖耗時(shí)較短，但敲低效果不穩(wěn)定。相比而言，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/LoxP策略特異性敲除肝臟TM6SF2可得到更穩(wěn)定敲除的小鼠模型。筆者通過肝臟病理診斷發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的小鼠肝臟出現(xiàn)典型的大泡小泡混合性脂肪變，但無(wú)明顯的小葉炎癥和氣球樣變性，表明在高脂飲食時(shí)肝臟敲除TM6SF2可加重小鼠單純性脂肪變，但并未觀察到相關(guān)非酒精性脂肪性肝炎表型。

本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/LoxP策略構(gòu)建穩(wěn)定的TM6SF2-HKO的小鼠模型，并研究其在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用。研究發(fā)現(xiàn)在高脂飲食條件下，肝細(xì)胞TM6SF2缺失可增加小鼠的肝質(zhì)量、肝指數(shù)、ALT水平和肝內(nèi)TG水平，證明TM6SF2-HKO可加重肝臟脂肪變性和肝損傷程度，進(jìn)一步證實(shí)肝臟TM6SF2在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究探究了肝臟TM6SF2在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的長(zhǎng)期作用，為今后進(jìn)一步研究TM6SF2在NAFLD中的作用奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張杰進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫論文；馬學(xué)峰、王藝奮進(jìn)行課題實(shí)施；王孟軻數(shù)據(jù)收集，參與起草文章；莊立琨、劉守勝進(jìn)行課題設(shè)計(jì)，參與修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；辛永寧進(jìn)行課題設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。