楊雪麗，薛建華，陳天陽(yáng)，平 鍵，侯天祿，陳建杰,，成 揚(yáng),

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所，上海 201203；2 上海浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院 肝病科，上海 201299

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新增肝癌患者90.6萬(wàn)人(在所有新發(fā)癌癥的占比4.7%)，居全部癌癥發(fā)病第6位，有83萬(wàn)人死于肝癌(在所有癌癥中占比8.3%)，居全部癌癥死亡第3位[1]。在我國(guó)，肝癌的發(fā)病率和死亡率均占全球總數(shù)的50%以上，占亞洲總數(shù)的70%左右[2]。近年來(lái)，盡管肝癌的早期診斷技術(shù)和治療水平不斷提高，但患者的5年生存率仍不理想[3]。早期肝癌患者治療方法有切除、肝移植或消融治療等，但由于肝癌起病隱匿，一旦確診常是晚期，晚期肝癌患者由于腫瘤負(fù)荷較大(伴有血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移)，介入治療、消融治療和放療效果有限，肝癌治療指南對(duì)晚期肝癌推薦全身系統(tǒng)性治療[4-6]。中醫(yī)藥的治療可貫穿肝癌治療的全過(guò)程，在改善患者臨床癥狀，減少術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者生存質(zhì)量等方面發(fā)揮著良好的協(xié)同作用[7]。近年來(lái)，中藥及中藥有效成分已成為開(kāi)發(fā)新型抗肝癌藥物的重要來(lái)源[8]。蒼術(shù)酮(Atractylone)是一種從蒼術(shù)(Atractylodeslancea)和北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis)中分離出來(lái)的倍半萜類(lèi)成分，現(xiàn)代藥理表明蒼術(shù)酮具有多種藥理活性，如改善潰瘍病灶血液循環(huán)、利尿、抗炎、抗腫瘤、保肝、降血糖、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等作用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)探討蒼術(shù)酮對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其作用機(jī)制，為蒼術(shù)酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株 肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)為SCSP-510，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所負(fù)責(zé)傳代，培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 蒼術(shù)飲片購(gòu)自上海華東藥業(yè)公司，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)鑒定，標(biāo)本(編號(hào)y20141022)存放于浙江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系。

1.1.3 試劑 胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)10437-028)；二甲基亞楓溶液(DMSO，上海源葉生物科技公司，批號(hào)20170204)；高糖培養(yǎng)基(DMEM)，青霉素-鏈霉素溶液(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)分別為SH3002201，sv30010)；RIPA裂解液，胰酶細(xì)胞消化液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，SDS-PAGE凝膠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P0013B，C0201，P0012，P0012A)；MTT試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)M1020)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)為559763)；B細(xì)胞淋巴瘤因子(Bcl-2)，Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)分別為CSB-E08853h，CSB-E09344h，CSB-E13911h)；半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3，英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab13847)。

1.1.4 儀器 多功能酶標(biāo)儀，轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)分別為iMark，1704150)；odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司，型號(hào)9120)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)51030286)。

1.2 方法

1.2.1 蒼術(shù)酮的制備 采用超臨界二氧化碳萃取法對(duì)蒼術(shù)酮進(jìn)行提取，按照本課題組前期經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行[11]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HepG2細(xì)胞在含10%FBS和1%雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，用胰酶消化傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組，蒼術(shù)酮低劑量組(5 μmol/L)、中劑量組(10 μmol/L)、高劑量組(20 μmol/L)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞活性 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于96孔板中(1×104/孔)，孵育過(guò)夜。蒼術(shù)酮用藥組分別加入含有不同濃度的蒼術(shù)酮(5、10、20 μmol/L)的溶液，對(duì)照組加入等體積的0.1%DMSO。分別孵育24、48、72 h，孵育結(jié)束后加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸棄上清液，加入150 μL DMSO，37 ℃條件下震蕩10 min溶解沉淀。使用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在570 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，分組培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后分組培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，使用PBS洗滌2次。加入1 mL Rhodamine 123(5 μg/mL)溶液，培養(yǎng)箱中孵育30 min，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位。

1.2.6 DCFH-DA法檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔),待細(xì)胞貼壁后分組培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，使用PBS洗滌2次，更換DCFH-DA培養(yǎng)基，按照ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于6孔板中(1×106/孔)，在培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。吸棄舊液，分組培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，使用含有PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，收集的細(xì)胞在4 ℃下以1000g離心25 min。BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和抗體孵育，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色使蛋白質(zhì)條帶可視化，獲取Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和GAPDH[12]的條帶圖片，并在Image J系統(tǒng)6.0版本下進(jìn)行定量分析。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞給予不同濃度的蒼術(shù)酮分組培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，離心，將HepG2細(xì)胞懸液按200 μL/室(5×104/孔)加入Transwell小室的上室，同時(shí)將500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入到下室，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。吸棄培養(yǎng)基，并棄去上室未遷移的細(xì)胞，用預(yù)冷的95%乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響 蒼術(shù)酮處理肝癌HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞活性。在蒼術(shù)酮處理細(xì)胞24、48 h后，與對(duì)照組同一時(shí)間相比，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組的細(xì)胞活性呈下降趨勢(shì)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖1)。此外，蒼術(shù)酮處理HepG2細(xì)胞72 h的半數(shù)抑制率(IC50值)為26.19 μmol/L(圖1)。

2.2 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組和蒼術(shù)酮低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡率分別為0.32%、14.34%、29.32%和50.12%，HepG2細(xì)胞凋亡率隨著蒼術(shù)酮藥物濃度的增加而升高，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；中、高劑量組細(xì)胞的凋亡率，與低劑量組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖2)。

圖2 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位丟失的影響 如圖3所示，對(duì)照組有5.65%的細(xì)胞丟失膜電位，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組分別有10.5%、16.5%和19.2%的細(xì)胞損失線粒體膜電位，4組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注:a,對(duì)照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組。

2.4 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 如圖4所示，對(duì)照組HepG2細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度較低，經(jīng)不同濃度的蒼術(shù)酮處理后，與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組HepG2細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度明顯升高(P值均<0.05)。

注:a,對(duì)照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組，e，蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平定量分析。

2.5 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響 如圖5和表1所示，在對(duì)照組中，大量的HepG2細(xì)胞從上室遷移到下室，在蒼術(shù)酮處理HepG2細(xì)胞48 h后，隨著蒼術(shù)酮藥物濃度的增加，對(duì)HepG2細(xì)胞遷移抑制效應(yīng)也逐漸增加。與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯降低(P值均<0.05)；中、高劑量組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于低劑量組(P值均<0.05)。

表1 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響

注:a,對(duì)照組；b，5 μmol/L組；c,10 μmol/L組；d,20 μmol/L組。

2.6 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與對(duì)照組比較，蒼術(shù)酮低、中、高劑量組能顯著抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡因子Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。對(duì)照組和蒼術(shù)酮用藥組的Bax/Bcl-2蛋白的比率分別為0.20、0.31、1.60、3.78。

圖6 蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞中Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

古代文獻(xiàn)并無(wú)“肝癌”病名，根據(jù)該疾病的典型特征和臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“癥瘕”“脅脹”“肝積”“伏梁”“黃疸”“肝著”“積聚”等[7]。蒼術(shù)是多年生菊科植物蒼術(shù)的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效，常用于治療濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、夜盲、眼干澀等病癥[13]，有研究[14]報(bào)道蒼術(shù)對(duì)肺癌、胃癌、食管癌、膽管癌、肝癌等有抑制作用，表現(xiàn)出抗腫瘤的藥理活性。蒼術(shù)酮是從蒼術(shù)中分離出來(lái)的倍半萜類(lèi)化合物，是中藥蒼術(shù)的有效成分之一，周域等[15]研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮能與維甲酸β受體緊密結(jié)合，產(chǎn)生維甲酸樣抗腫瘤作用。耿煒等[16]研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有抗結(jié)直腸癌的作用。本研究主要探討蒼術(shù)酮對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和遷移的作用和其可能作用機(jī)制，為蒼術(shù)酮應(yīng)用與肝癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡，是由外界刺激因素誘發(fā)后，經(jīng)一系列基因活化及調(diào)控細(xì)胞有序的、自主的主動(dòng)死亡過(guò)程[17]，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)以及對(duì)抗有害和潛在危險(xiǎn)細(xì)胞的防御機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，線粒體信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著較為重要的作用[18]。線粒體損傷的特征是線粒體膜電位的丟失使膜通透性增加，線粒體中細(xì)胞凋亡因子如細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中形成凋亡復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。此外，ROS可促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體上解離，因此ROS水平升高可進(jìn)一步介導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡[20]。本研究表明蒼術(shù)酮可顯著促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)線粒體膜電位的丟失，增加肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位的丟失。

研究[21]表明，在眾多的凋亡相關(guān)基因中，Bcl-2基因家族在凋亡過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，它可以在細(xì)胞周期的任何階段直接抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞存活周期并誘發(fā)細(xì)胞癌變[22]。在正常狀態(tài)下，Bax存在于細(xì)胞質(zhì)中并與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，從而使促凋亡蛋白穩(wěn)定于細(xì)胞質(zhì)中，并抑制細(xì)胞凋亡[23]。Bax/Bcl-2的比率是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素[24-25]，若Bcl-2蛋白的含量相對(duì)下降，Bax將移位于線粒體膜上，刺激線粒體釋放促凋亡因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。Caspase-3是caspase家族中參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，并位于細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心位置，Cleaved caspase-3是裂解后的caspase-3，是誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因子，是反映細(xì)胞凋亡可靠的指標(biāo)[27-28]。本研究表明蒼術(shù)酮顯著增加促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，蒼術(shù)酮可能是通過(guò)降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明蒼術(shù)酮對(duì)HepG2細(xì)胞具有體外其抑制活性、遷移的作用，并通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果為后續(xù)蒼術(shù)酮在體內(nèi)對(duì)肝癌活性的研究和進(jìn)一步研究其抑制腫瘤遷移的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為蒼術(shù)酮治療肝癌的臨床應(yīng)用提供參考。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊雪麗、薛建華、陳天陽(yáng)負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)操作及撰寫(xiě)論文；平鍵、侯天祿負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫(xiě)作思路，修改論文；陳建杰、成揚(yáng)指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。