劉旭凌，楊廣越，張 瑋，孫田甜，馬文婷，吳 柳，薛冬英，劉 成a,，陶 樂(lè)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 a.肝病實(shí)驗(yàn)室，b.感染科，c.中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200062

肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的中間過(guò)程，抗纖維化可在一定程度上阻止肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生[1]。肝纖維化主要是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增生與降解失衡。肝星狀細(xì)胞(HSC)是ECM產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，有效抑制HSC活化對(duì)抗纖維化治療有重要意義。研究顯示中藥可以改善抑制肝纖維化患者肝組織病理學(xué)進(jìn)展、減少肝硬化靜脈曲張出血發(fā)生率等。出自經(jīng)典方劑的“桃紅四物湯”是養(yǎng)血活血方藥，對(duì)肝纖維化等肝臟疾病具有良好的治療效果[2]，桃紅四物湯及方中桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸等單味藥均顯示出明顯的抗肝纖維化作用[3-4]，但其機(jī)制尚未明確。

透明質(zhì)酸(HA)主要存在ECM中，是肝纖維化的重要標(biāo)志物。HA合成酶(hyaluronan synthase，HAS)是合成HA的重要分子，其中HAS-2可以催化合成高分子量HA，是抗肝纖維化的重要靶點(diǎn)[5-6]。本研究通過(guò)建立CCl4小鼠模型，探討桃紅四物湯對(duì)CCl4所致肝纖維化的干預(yù)作用，進(jìn)一步以HAS-2為切入點(diǎn)，研究探討桃紅四物湯抗肝纖維化的作用機(jī)制，以期為桃紅四物湯治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠24只，清潔級(jí)，6～8周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(滬)2019-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2019-0020。飼養(yǎng)室溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 藥物與試劑 參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，采用道地藥材，生藥學(xué)專家鑒定。統(tǒng)一由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑中心一次制備后冷凍干燥保存。桃仁9 g，紅花6 g、當(dāng)歸15 g、熟地黃15 g、川芎8 g、白芍10 g均購(gòu)自上海華宇藥物有限公司，制成粗粉末后以75%乙醇提取2次，提取液濃縮成浸膏(THSWD)，真空干燥后冷藏保存。主要試劑：ALT、AST檢測(cè)試劑盒(C009-2、C010-2-1)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；SABC免疫組化試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，ab5694)、HAS-2、ab140671購(gòu)自Abcam公司；Ⅰ型膠原(Col1，NB600-408)購(gòu)自Novus，GAPDH(AP0063)購(gòu)自Bioworld；引物(α-SMA、Col1α1、HAS-1、HAS-2、HAS-3)由上海生工生物科技有限公司合成；RNA提取試劑Trizol(9109)、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)及SYBR(RR420)均購(gòu)自Takara公司；DAB購(gòu)自北京中杉金橋(ZLI-9018)；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司(23227)；PVDF膜購(gòu)自Merck Millipore公司(IPVH00010)。

1.1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀(Thermo Varioskan LUX)，超微量分光光度計(jì)(Berthold Detection Systems，colibri)，普通PCR儀(Bio-RAD，T100)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀(ABI，VIIA 7 DX)，電泳儀(Bio-Rad，PowerPacTM Basic 041BR127719)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司，JS-1060)，半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245)，自動(dòng)脫水機(jī)(TP1020)，包埋機(jī)(EG1150H)，全自動(dòng)染色機(jī)(ST5010)，自動(dòng)封片機(jī)(CV5030)均購(gòu)自Leica公司，熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司(BX43)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組、造模和給藥 24只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和桃紅四物湯組，每組8只。模型組和桃紅四物湯組小鼠腹腔注射10% CCl4，0.04 ml/只，每周3次，連續(xù)6周；正常組小鼠相同時(shí)間腹腔注射等體積橄欖油。造模第3周起，桃紅四物湯組按照成人體質(zhì)量(70 kg)10倍的量，每日1次灌胃，正常組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.2.2 標(biāo)本采集 藥物干預(yù)4周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，麻醉小鼠后腹主動(dòng)脈采血，血液靜置1 h后3000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取血清，隨后取小鼠肝組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 肝功能指標(biāo)檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組小鼠血清ALT、AST水平。

1.2.4 肝組織病理學(xué)觀察 選取肝右側(cè)最厚一葉，切取0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm大小肝組織1塊，10%中性福爾馬林固定，自動(dòng)脫水機(jī)逐級(jí)酒精脫水、二甲苯透明，包埋、4 μm切片，觀察組織的病理變化。HE染色觀察組織學(xué)損傷。天狼星紅染色：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水5 min×3次，滴加天狼星紅染色液，30 ℃孵育30 min，無(wú)水乙醇沖洗，晾干后封片。免疫組化染色：石蠟切片脫蠟至水，1%檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育5～10 min，PBS清洗，3 min×3次，5%BSA封閉30 min，一抗抗體α-SMA、HAS-2 4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗，3 min×3次。滴加北京中杉試劑盒中相應(yīng)二抗，37 ℃孵育20 min，PBS清洗，3 min×3次；第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS清洗，3 min×3次。顯色劑顯色(DAB或AEC)。自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。采用Image-pro plus 6.0分析病理圖片的陽(yáng)性染色區(qū)域。

1.2.5 總RNA提取 Trizol法提取肝臟RNA，將提取的總RNA溶解于DEPC水，測(cè)RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄：按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以18S為內(nèi)參，擴(kuò)增引物由引物原液與滅菌水合成。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min。擴(kuò)增：取cDNA 3 μL加SYBR Green 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 1.2 μL，制成10 μL體系，反應(yīng)條件為：95 ℃、30 min預(yù)變性，95 ℃、5 s變性，60 ℃、30 s退火，40個(gè)循環(huán)，60 ℃、1 min延伸。PCR結(jié)束采用2-ΔΔCt法分析計(jì)算目的基因表達(dá)。

1.2.6 纖維化及相關(guān)因子的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)α-SMA、Col1、Has-1、HAS-2和HAS-3的mRNA表達(dá)水平，引物由上海生工生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。Western Blot檢測(cè)α-SMA、Col1、蛋白的表達(dá)。將0.1 g肝組織加入預(yù)冷的RIPA(含蛋白酶抑制劑)勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取上清。蛋白定量，取20 μg樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至PVDF膜，封閉1 h；一抗α-SMA和Col1，4 ℃過(guò)夜，鼠二抗(1∶5000)/兔二抗(1∶5000)室溫孵育60 min，ECL顯影，采用Image J分析Western Blot的蛋白表達(dá)灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.7 小鼠原代HSC分離 C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，仰臥位固定四肢，剖開(kāi)腹部暴露門(mén)靜脈及下腔靜脈，將24G留置針插入門(mén)靜脈，將前灌流液25 mL以5 mL/min的速度充分灌注約5 min至肝臟變?yōu)榫鶆虻耐咙S色；更換為0.2 g/L鏈霉蛋白酶溶液(含25 mL)灌注約5 min，再更換為0.3 g/L的Ⅳ型膠原酶溶液(30 mL)灌注約5 min；灌流完畢后摘除肝臟，剔除肝包膜及膽囊，輕柔撕碎肝組織，將肝組織移入分散液(30 mL)，37 ℃搖床消化15 min，用100 μm孔徑的過(guò)濾肝組織懸液，加入20%胎牛血清2 mL終止消化。細(xì)胞懸液37 ℃、1700 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀細(xì)胞，加入30 mL無(wú)血清GBSS/B懸混勻后再次37 ℃、1700 r/min離心5 min，棄上清，加入10 mL MEM培養(yǎng)基、1.5 mL DNA酶Ⅰ、8.5 mL 28.7%密度梯度分散液(Nycodenz)混勻成細(xì)胞懸液，用移液槍緩慢鋪10 mL GBSS/A，24 ℃ 1450 g離心22 min，離心后可見(jiàn)細(xì)胞分層，吸取中間白膜層細(xì)胞，加入無(wú)血清MEM培養(yǎng)基，1700 r/min 離心5 min重復(fù)2次清洗細(xì)胞碎片，最終將細(xì)胞重懸加入20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。

1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng) 桃紅四物湯處理細(xì)胞參照本課題組既往文獻(xiàn)[7]方法。分離原代HSC，培養(yǎng)于DMEM-10%胎牛血清-2%雙抗培養(yǎng)基，24 h后換液，48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染siRNA：細(xì)胞饑餓處理6 h，配制Opti-MEN+LTX+si-RNA質(zhì)粒(終濃度100 pmol)混合液。靜置20 min后將混合液加到培養(yǎng)皿中，處理6 h后換成DMEM-10%胎牛血清+1%雙抗培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞48 h后處理。TGFβ使用終濃度為5 ng/mL。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PTEC-A-2016-4(G)-1。符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯治療CCl4肝纖維化小鼠肝損傷 與正常組小鼠相比，模型組小鼠ALT、AST水平均升高(P值均<0.01)；而桃紅四物湯組與模型組相比小鼠血清ALT、AST均顯著降低(P值均<0.01)(表2)。

HE染色結(jié)果顯示：正常組肝細(xì)胞索從中央靜脈呈放射狀排列，模型組小鼠肝小葉間炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，桃紅四物湯可顯著抑制炎性浸潤(rùn)(圖1a)。桃紅四物湯組肝臟炎性細(xì)胞面積較模型組明顯減小(P<0.01)(表2)。天狼星紅染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁可見(jiàn)少量膠原纖維，模型組小鼠肝組織可見(jiàn)增生的膠原纖維分割肝小葉形成較粗大的間隔，部分假小葉形成；桃紅四物湯組小鼠肝組織纖維間隔較窄、排列疏松且不連續(xù)(圖1b)。與模型組相比，桃紅四物湯組天狼星紅面積顯著減少(P<0.01)(表2)。

表2 各組血清轉(zhuǎn)氨酶水平及病理學(xué)改變

注：a，HE染色，×100；b，天狼星紅染色，×100。

2.2 各組α-SMA、Col1 mRNA和蛋白表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示：與模型組相比，桃紅四物湯組α-SMA、Col1 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P值均<0.001)；免疫印跡結(jié)果顯示：與模型組相比，桃紅四物湯組α-SMA、Col1 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P值均<0.001)。免疫組化結(jié)果顯示：在正常組小鼠肝組織中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)僅存在于匯管區(qū)動(dòng)靜脈血管壁上；CCl4模型組小鼠α-SMA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，密布于匯管區(qū)，炎癥浸潤(rùn)區(qū)及膠原纖維增生處，沿假小葉結(jié)構(gòu)分布；桃紅四物湯組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)主要存在于匯管區(qū)血管壁，肝竇處亦有分布，陽(yáng)性表達(dá)水平較模型組明顯減少(P<0.01)(圖2，表3)。

表3 各組α-SMA、Col1表達(dá)水平比較

注：a，α-SMA免疫組化結(jié)果(×100)；b，α-SMA、Col1免疫印跡結(jié)果。

2.3 各組HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA和HAS-2蛋白表達(dá)情況 與正常組比較，模型組肝組織中HAS-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而HAS-1、HAS-3表達(dá)水平均無(wú)顯著變化(表4)(P值均>0.05)。進(jìn)一步通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)：HAS-2分布于變性的肝細(xì)胞，纖維化區(qū)，肝竇區(qū)、匯管區(qū)，血管壁；桃紅四物湯組HAS-2陽(yáng)性表達(dá)水平(0.29±0.10)較模型組(1.00±0.12)明顯減少(t=70.73，P<0.001)，免疫印跡結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致(圖3)。

表4 各組HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表達(dá)情況

注：a，HAS-2免疫組化結(jié)果(×100)；b，HAS-2免疫印跡結(jié)果。

2.4 桃紅四物湯調(diào)控HSC HAS-2表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化作用 在分離小鼠原代HSC，TGFβ(5 ng/ml)處理HSC 48 h后，TGFβ處理組的α-SMA、Col1、HAS-2 mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組(PBS處理)顯著升高(P值均<0.01)(表5)。

表5 α-SMA、Col1、HAS-2 mRNA在原代HSC中的表達(dá)水平

與NC組相比，TGFβ處理后(NC+TGFβ組)，α-SMA、Col1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P值均<0.01)，桃紅四物湯處理后(NC+TGFβ+THSWD組)，α-SMA、Col1 mRNA表達(dá)水平較NC+TGFβ組顯著降低(P值均<0.01)；siRNA沉默HAS-2，TGFβ處理后(Si HAS-2+TGFβ組)α-SMA、Col1 mRNA表達(dá)水平較NC+TGFβ組顯著降低(P值均<0.01)，而桃紅四物湯處理后(Si HAS-2+TGFβ+THSWD組)，與Si HAS-2+TGFβ組相比，α-SMA、Col1 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P值均>0.05)(表6)。

表6 基因沉默HAS2檢測(cè)THSWD對(duì)HSC活化的影響

3 討論

肝纖維化形成過(guò)程和機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多，中醫(yī)辨證認(rèn)為肝纖維化的病機(jī)主要是“氣虛、血瘀”。目前研究[8-10]發(fā)現(xiàn)一些中成藥具有顯著的抗肝纖維化作用。經(jīng)典方劑桃紅四物湯的主要功效是“養(yǎng)血活血”，與肝纖維化的病機(jī)相鍥合，已有報(bào)道[2]顯示該方對(duì)臨床慢性肝病有良好的治療效果，但其機(jī)制尚未明確。

各種病因均可繼發(fā)性激活HSC導(dǎo)致肝纖維化[11]。肝纖維化的發(fā)生主要是由于ECM的增生與降解失衡，導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積[12]，而HA是ECM的重要組成部分[6]。相對(duì)于催化合成高分子量和短鏈HA的HAS-1、HAS-3，催化合成低分子量的HAS-2是細(xì)胞合成HA的關(guān)鍵酶，在ECM組成中起主要作用[13]，在HSC活化中HAS-2可通過(guò)TGFβ信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝纖維化[14]，為此本研究進(jìn)一步通過(guò)桃紅四物湯干預(yù)CCl4肝纖維化模型，結(jié)合分離培養(yǎng)小鼠原代HSC，探究桃紅四物湯在抗肝纖維化過(guò)程中HAS-2發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示，CCl4肝纖維化模型組小鼠ALT、AST水平明顯升高，在桃紅四物湯干預(yù)后肝功能指標(biāo)得到恢復(fù)，表明桃紅四物湯具有保護(hù)小鼠肝損傷的作用。HE及天狼猩紅染色結(jié)果提示桃紅四物湯可有效減輕CCl4模型小鼠的肝損傷，改善肝組織炎癥及減輕纖維化；免疫組化結(jié)果顯示，CCl4模型組小鼠α-SMA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于匯管區(qū)，炎癥浸潤(rùn)區(qū)及膠原纖維增生處，沿假小葉分布，而桃紅四物湯組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)量較CCl4模型組明顯減少。提示桃紅四物湯可有效減輕CCl4模型組小鼠肝損傷，改善肝組織炎癥及減輕纖維化。RT-PCR和免疫印跡結(jié)果證實(shí)了桃紅四物湯的有效性，其作用與抑制HSC活化密切相關(guān)。

HA是一種重要的氨基聚糖，是ECM的主要成份，也是肝纖維化的重要標(biāo)志物。HA合酶家族的3種成員(HAS-1、HAS-2、HAS-3)均可合成HA[14]，其中活性最低、作用較弱的是HAS-1，主要功能是合成高分子量的HA；HAS-2活性較強(qiáng)，合成低分子量HA；而短鏈HA由活性最強(qiáng)的HAS-3合成。研究[15]表明，在HA以及ECM形成的過(guò)程中，HAS-2作為關(guān)鍵酶參與；在肝纖維化患者中，HA和HAS-2的表達(dá)升高。本研究顯示，在CCl4模型組中HAS-2 mRNA的表達(dá)顯著升高，而HAS-1、HAS-3 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著變化，CCl4模型組的HAS-2表達(dá)廣泛分布于纖維間隔；而免疫印跡和RT-PCR結(jié)果均顯示桃紅四物湯組HAS-2表達(dá)均顯著降低，表明桃紅四物湯抗肝纖維化作用可能通過(guò)調(diào)控HAS-2表達(dá)實(shí)現(xiàn)。TGFβ可誘導(dǎo)HSC的HAS-2表達(dá)及纖維化指標(biāo)表達(dá)顯著升高。桃紅四物湯可顯著抑制TGFβ誘導(dǎo)的小鼠HSC活化和纖維化的表達(dá)，但基因沉默HAS-2后，桃紅四物湯不能有效抑制HSC活化，表明桃紅四物湯抑制HSC活化和肝纖維化是通過(guò)調(diào)控HAS-2實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，桃紅四物湯可改善肝功能和減輕肝纖維化，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控HSC的HAS-2信號(hào)通路發(fā)揮作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉旭凌負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；楊廣越、張瑋、孫田甜、馬文婷、薛冬英、吳柳參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉成、陶樂(lè)負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。