周燕 郭珊嵐 蘭秀君 楊君華
慢性腎衰竭(CRF)是各種慢性腎臟疾病導(dǎo)致腎功能障礙直至衰竭的現(xiàn)象,病理變化多出現(xiàn)腎小球功能變化和腎間質(zhì)改變[1]。其中腎小球基膜(GBM)增生會降低腎小球濾過率,加重疾病,因此減緩GBM增生對緩解CRF具有保護作用。木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性;筋骨草主要成分為木犀草素,在系膜增生性腎小球腎炎中具有緩解疾病效果[2],但對GBM增生的作用尚不明確。c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)均屬應(yīng)激活化蛋白激酶,可被炎癥、纖維化等激活,激活MAPK信號通路可刺激腎臟細胞增殖分化、促進纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)等合成[3-4],加重腎臟相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展。推測木犀草素可能通過JNK/MAPK信號通路從而影響CRF大鼠GBM增生?;诖?本研究采用腺嘌呤溶液連續(xù)灌胃21天建立CRF大鼠模型,探究木犀草素對CRF大鼠的影響,并初步探討其機制。
1.材料:實驗動物:健康SD大鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,SDF級,許可證號:SCXK(京)2018-0021,體質(zhì)量(200±20)g]于我院動物實驗中心以溫度(25±1)℃、濕度(50±5)%、12 h光照/12 h黑暗飼養(yǎng)。試劑:腺嘌呤(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);木犀草素(德國Sigma公司);鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司);蘇木素-伊紅(HE)、改良三色染色(Masson染色)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗一抗JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、p38 MAPK、絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、二抗羊抗兔、FN酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國abcam公司);ColⅣ ELISA試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)。儀器:全自動生化分析儀(北京泰林東方商貿(mào)有限公司)。本實驗經(jīng)我院倫理委員會審批通過。
2.方法
(1)實驗動物模型建立:將50只SD大鼠隨機分為模型組、木犀草素低、中、高劑量組、陽性對照組,每組各10只,根據(jù)參考文獻[5]中的方法建立大鼠CRF模型,以25%腺嘌呤溶液(250 mg/kg)連續(xù)灌胃21天,造模結(jié)束后第7天時,木犀草素低、中、高劑量組大鼠分別以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg木犀草素灌胃,陽性對照組大鼠以2 mg/kg貝那普利灌胃[6];另取10只大鼠作為正常組,正常組和模型組大鼠以等體積生理鹽水每天1次灌胃,均連續(xù)灌胃28 d,正常組大鼠在此期間正常飲食飲水。實驗結(jié)束后收集代謝籠中24 h尿液;腹主動脈取血;收集左側(cè)腎臟,部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80 ℃冰箱中待檢。
(2)大鼠一般情況收集:觀察各組大鼠實驗結(jié)束后的精神狀態(tài),于實驗前、后分別記錄體質(zhì)量,并收集24 h尿液,采用全自動生化分析儀檢測大鼠24 h尿蛋白水平。
(3)HE、Masson染色觀察腎臟組織形態(tài):大鼠腎臟于4%多聚甲醛中過夜后取出,制備常規(guī)石蠟切片后進行HE、Masson染色。采用光學(xué)顯微鏡拍照觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)。
(4)腎功能生化指標(biāo)檢測:采用自動生化分析儀檢測血液中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)水平。
(5)蛋白質(zhì)免疫印跡檢法測腎臟組織JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK水平:于-80 ℃冰箱中取部分腎臟組織,在冰上研磨并裂解30 min,提取總蛋白,凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后PVDF轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入一抗JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、GADPH,4 ℃孵育過夜;加入對應(yīng)二抗,室溫孵育2 h。采用蛋白凝膠成像儀拍照和灰度分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度/相對內(nèi)參灰度。
(6)ELISA檢測腎臟組織中FN及ColⅣ水平:于-80 ℃冰箱取部分腎臟組織在冰上研磨并裂解30 min,采用ELISA試劑盒檢測腎臟組織中FN、ColⅣ水平。
1.6組大鼠實驗前后體質(zhì)量、24 h尿量及24 h尿蛋白水平比較:實驗后,模型組大鼠精神狀態(tài)較差,體質(zhì)量低于同期正常組,24 h尿量、24 h尿蛋白水平均高于同期正常組(P<0.05);木犀草素中、高劑量組、陽性對照組大鼠精神狀態(tài)較同期模型組均有一定程度改善,體質(zhì)量較同期模型組均升高,24 h尿量、24 h尿蛋白較同期模型組均降低(P<0.05)。見表1。
表1 6組大鼠實驗前后體質(zhì)量、24 h尿量及24 h尿蛋白水平比較
2.6組大鼠腎臟組織HE、Masson染色結(jié)果:光鏡下可見正常組腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰,腎小球結(jié)構(gòu)正常;模型組GBM增生,腎小管萎縮,局部灶紊亂明顯,腎小球和腎小管纖維膠原沉積現(xiàn)象明顯;與模型組比較,木犀草素低、中、高劑量組隨劑量增加GBM增生現(xiàn)象緩解,腎小球和腎小管纖維化程度降低,陽性對照組腎臟組織GBM增生不明顯,但腎小球和腎小管纖維化明顯。見圖1。
圖1 6組大鼠腎臟組織病理染色結(jié)果(A、G:正常組;B、H:模型組;C、I:木犀草素低劑量組;D、J:木犀草素中劑量組;E、K:木犀草素高劑量組;F、L:陽性對照組;A、B、C、D、E、F:HE染色;G、H、I、J、K、L:Masson染色;×200)
3.6組大鼠SCr、BUN、UA、FN、ColⅣ水平比較:與正常組比較,模型組SCr、BUN、UA、FN、ColⅣ水平均升
高(P<0.05);與模型組比較,木犀草素低劑量組BUN、UA、ColⅣ水平均降低,木犀草素中、高劑量組、陽性對照組SCr、BUN、UA、FN、ColⅣ水平均降低(P<0.05)。見表2。
4.6組大鼠腎臟組織中JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38MAPK水平比較:與正常組比較,模型組腎臟組織p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平均升高(P<0.05);與模型組比較,木犀草素中、高劑量組、陽性對照組腎臟組織中p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平均降低,木犀草素低劑量組腎臟組織中p-p38 MAPK/p38 MAPK水平降低(P<0.05)。見圖2、表3。
組別SCr(μmol/L)BUN(mmol/L)UA(μmol/L)FN(ng/ml)ColⅣ(ng/ml)正常組50.46±12.456.08±1.5353.44±8.6619.46±3.1524.75±3.53模型組186.48±20.18a16.43±2.14a130.46±11.33a63.55±12.15a53.22±7.26a木犀草素低劑量組173.66±14.8613.46±1.44b100.58±8.16b56.45±10.1641.17±6.33b木犀草素中劑量組143.18±12.19b10.35±2.19b76.59±8.39b41.14±6.45b32.84±5.49b木犀草素高劑量組89.96±9.18b8.66±1.34b61.69±7.34b25.56±4.18b27.46±4.12b陽性對照組106.47±10.32b8.98±1.86b64.58±6.98b21.16±4.53b31.45±3.86bF值145.45843.493115.16462.93439.396P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001
圖2 6組大鼠腎臟組織中JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK水平(A:正常組;B:模型組;C:木犀草素低劑量組;D:木犀草素中劑量組;E:木犀草素高劑量組;F:陽性對照組)
組別JNK/GADPHp-JNK/JNKp38 MAPK/GADPHp-p38 MAPK/p38 MAPK正常組0.89±0.180.16±0.050.31±0.060.36±0.05模型組0.92±0.210.98±0.18a0.32±0.051.23±0.21a木犀草素低劑量組0.90±0.180.86±0.150.29±0.041.03±0.17b木犀草素中劑量組0.87±0.140.54±0.12b0.34±0.030.86±0.09b木犀草素高劑量組0.93±0.150.32±0.07b0.32±0.040.05±0.01b陽性對照組0.91±0.130.35±0.04b0.33±0.030.07±0.01bF值0.166780.4211.604184.783P值0.974<0.0010.173<0.001
CRF會出現(xiàn)免疫力低下、神經(jīng)功能障礙等多種并發(fā)癥,影響機體正?;顒?對機體危害嚴(yán)重[7]。木犀草素屬黃酮類化合物,具有抗凝血、擴張血管、抗炎、促進免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn),CRF大鼠腎臟組織中腎小球和腎小管出現(xiàn)功能障礙,使腎臟組織濾過性降低,尿蛋白量增加,機體蛋白流失,從而降低大鼠體質(zhì)量,使其精神變差,而木犀草素可能通過減弱GBM增生、使腎小球擴張從而緩解大鼠尿蛋白水平增加、體質(zhì)量降低現(xiàn)象,并改善精神狀態(tài)。
SCr、BUN、UA均可反映腎功能損傷情況。其中SCr屬肌肉代謝產(chǎn)物,BUN屬血漿中含氮化合物,UA為嘌呤代謝產(chǎn)物,正常情況下均由腎小球濾過排泄體外,而腎功能障礙時在體內(nèi)積累,對機體造成傷害[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn),CRF大鼠腎小球功能出現(xiàn)障礙,濾過率降低,導(dǎo)致SCr、BUN、UA在體內(nèi)累積,損害機體健康。木犀草素處理CRF大鼠后可緩解其腎功能,使腎小球濾過率升高,降低SCr、BUN、UA水平,實現(xiàn)對機體的保護。
JNK作為MAPK家族的主要成員之一,活化后可與多種基因結(jié)合發(fā)揮作用[11];在腎小球損傷反應(yīng)性GBM增生中處于活化狀態(tài),抑制JNK活化,可有效抑制細胞增殖[12]。p38 MAPK作為MAPK家族的另一重要成員,在局部灶腎小球硬化中可通過結(jié)締組織生長因子促進細胞外基質(zhì)沉積和FN產(chǎn)生,加速疾病進程[13]。JNK可識別MAPK序列,組成蛋白復(fù)合物發(fā)生作用,活化的JNK與p38 MAPK通過促進作用,共同調(diào)控刺激分子發(fā)揮作用[14]。如共同促進作用調(diào)控激活蛋白-1活化,其中FN上存在激活蛋白-1位點,調(diào)控激活蛋白-1活化可間接促進FN活化;FN作為GBM的主要成分,過表達可導(dǎo)致GBM細胞增生,加重腎小球病變[15-16]。FN、ColⅣ均作為GBM和毛細血管基膜重要成分,與GBM細胞增生關(guān)系密切,過度升高可導(dǎo)致GBM異常增生[17]。本研究發(fā)現(xiàn),CRF中JNK、p38 MAPK均處于活化狀態(tài),激活JNK、p38 MAPK可促進細胞外基質(zhì)沉淀和促進FN、ColⅣ水平升高,而FN、ColⅣ作為GBM的主要成分,其水平升高可促進GBM增生,加快疾病進程。木犀草素可通過抑制上述過程實現(xiàn)對GBM增生的緩解從而實現(xiàn)對CRF大鼠的保護。
綜上所述,本文發(fā)現(xiàn)木犀草素對CRF大鼠具有保護作用,木犀草素可緩解CRF導(dǎo)致的GBM增生,可能是通過抑制JNK/MAPK信號通路實現(xiàn)的。