章建瀛 王清水 鐘雯婷 林幼玉

【摘要】基因組編輯技術是幫助治療方法最具挑戰(zhàn)性但最有效的工具之一。Crispr可以提高基因編輯的效率，并盡量減少脫靶率。定期排列的短回文重復序列（CRISPR）相關蛋白（Cas9）是一種革命性的基因組編輯技術。CRISPR/Cas9在多種疾病中的新應用已經證明了它的有效性，并已應用于體外體細胞和多能干細胞的模型，以及體內動物模型，最終可能被用來糾正有缺陷的基因。本綜述的重點是CRISPR/Cas9的最近應用及其對治療具有挑戰(zhàn)性的人類疾病的貢獻，例如各種類型的癌癥、神經退行性疾病和廣泛的其他疾病。CRISPR技術是一種新的疾病治療方法，提高了藥物的有效性，促進了個性化醫(yī)學的發(fā)展。

【關鍵詞】CRISPR，Cas9，基因編輯，基因治療，人類疾病

【中圖分類號】R-3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）08-104-03

English abstract：Genome editing techniques are considered to be one of the most challenging yet efficient tools for assisting therapeutic approaches. Several studies have focused on the development of novel methods to improve the efficiency of gene editing，as well as minimise their off-target effects.The focus of the present review was the recent applications of CRISPR/Cas9 and its contribution to the treatment of challenging human diseases，such as various types of cancer，neurodegenerative diseases and a broad spectrum of other disorders. CRISPR technology is a novel method for disease treatment，enhancing the effectiveness of drugs and improving the development of personalised medicine.

Keywords：CRISPR，cas9，gene editing，gene therapy，human diseases

細菌和古細菌在長期演化過程中，形成的一種獲得性免疫防御體系，即CRISPR/Cas9，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。crRNA與 tracrRNA可以通過堿基配對形成復合體，這種復合體可以介導核酸內切酶酶 Cas9蛋白在特定位點剪切雙鏈DNA，而人為去設計這兩種RNA可以介導對 DNA 雙鏈進行定點切割、DNA 序列的敲除、插入、定點突變以及組合編輯[1]。

II型CRISPR-Cas系統(tǒng)相比于I型和III型，結構比較簡單，執(zhí)行生物功能的部分僅由Cas9和tracrRNA：crRNA兩個部分組成，而且操作更加簡便。之前的研究曾將tracrRNA和crRNA分別表達形成雙引導RNA系統(tǒng)，但這種系統(tǒng)容易引起非同源重組介導插入缺失的錯誤修復，但后來發(fā)現將crRNA與tracrRNA編輯合成單一的RNA嵌合體，也可以指導Cas進行切割[2]。通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合后的RNA具有與crRNA：tracrRNA復合體類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作。

質粒等載體通過tracrRNA：crRNA介導Cas9切割的位點是有特異性的，即PAM序列上游的三個堿基對處。PAM僅有幾個堿基構成（通常為NGG），它可以根據CRISPR/Cas系統(tǒng)的類型定位并精確排序[2]。PAM 序列是Cas9識別靶DNA的重要影響因素。目前研究表明，II型CRISPR特異性靶位點必須完美結合PAM序列和在gRNA3’末端的seed sequence 8-12個堿基[1]。

由于編輯基因效率高、設計操作簡單與在多種細胞中通用性好等優(yōu)勢，CRISPR-Cas9 的基因組編輯技術成為ZFNs 與TALENs 之后的新一代基因組編輯技術。為了測CRISPR-Cas9系統(tǒng)HR（同源重組）的效率，研究者設計兩種gRNA（T1和T2）作用于AAVS1片段，并且與之前了解到的TALEN技術進行活性比較。圖中，通過流式細胞技術明顯可以看出donor+ hCas9+T1 gRNA組、donor+hCas9+T2gRNA組比donor+AAV51 TALENs組的同源重組率要高得多[1]。ZFNs技術和TALENs都是之前已知已應用于基因組編輯人工核酸內切酶的方法，這兩種方法只能在DNA的單鏈形成缺口，有一定的技術局限，而且成本較高，而CRISPR/Cas9酶可以在可以在DNA雙鏈上形成缺口，操作比較簡單并且效果顯著。

CRISPR的II型系統(tǒng)內，為了識別并在目標DNA上形成雙鏈切口，有幾個結構是很重要的，一是crRNA與tracrRNA這兩種RNA組成的dual-RNA結構或類似結構（sgRNA），二是Cas9內切酶，三是特定的位點即PAM序列。編輯好的Cas9內切酶與設計成一個單一轉錄因子的gRNA相互配合，可以標記并切割DNA序列。CRISPR-Cas9為基因靶標和基因編輯應用提供了更多可能性[2]。

CRISPR/Cas9技術的應用

一、在人類細胞基因水平上CRISPR-Cas9基因敲出、篩選。

通過編輯CRISPR關聯的內切酶Cas9去修改特定的基因底座是一種新方法，這種方法可以更簡單地了解基因的在全基因組水平上的功能。基因水平上CRISPR-Cas9 基因敲除庫已經標記了18080個基因和64751個獨特的引導序列可以用于在人類細胞中的陰性篩選和陽性篩選。首先，在癌細胞和多能干細胞中使用GeCKO（genome-scale CRISPR-Cas9 knockout）庫識別細胞存活必要基因，接著，在黑色素瘤模型中篩選缺失vemurafenib抑制劑的基因。研究者研究得到的最好的候選基因有NF1、MED12、NF2、CUL3、TADA2B和 TADA1。通過一系列實驗，不同的gRNA靶向相同的基因有很高的命中率，確定Cas9基因篩選前景的光明[4]。

GeCKO篩選是一個系統(tǒng)而獨特的方法，用RNA抑制劑干擾基因的功能。RNA抑制劑會減少目標RNA蛋白的表達量，而GeCKO可以引導功能缺失的突變體進入DNA。RNA抑制劑可以限制轉錄，而Cas9：sgRNAs可以識別基因組內的很多因子，比如啟動子：增強子、內含子和基因間隔區(qū)。此外，催化Cas9不活躍的突變體可以根據不同功能域被分類，進而擴大其干擾方式，包括基因組功能篩選的應用、Cas9的激活和表觀遺傳修飾。運用不同sgRNA有效進行完全基因敲除有著高度一致性，因此通過Cas9：sgRNA技術改變基因組的功能是可行的[4]。

二、用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯多種基因

選擇性干擾個別基因原件造成的基因突變需要精準有效地基因識別技術，雖然之前已經有ZFs、TALEs等技術可以以DNA為靶標，但是不夠有廣泛性而且成本較高。因此研究者設計了新的基因編輯工具，這個工具是基于II型原核生物的CRISPR獲得性免疫系統(tǒng)的RNA引導Cas9核酸酶制作而來的。II型原核CRISPR的獲得性免疫系統(tǒng)已被證明能促進RNA指導的特殊位點DNA切割。研究者設計了兩種不同的II型CRISPR系統(tǒng)，并且證明了可以用短序列RNA指導Cas9核酸精準切割在人類以及小鼠細胞內的內源基因座。Cas9也可以修飾成切口酶，用最小的致突變活性促進同源定向修復[5]。

研究者在哺乳動物細胞編碼SpCas9和RNaseIII并附上核苷酸定位因子以便區(qū)分。這些結構在人類的293FT細胞中表達，說明兩種核酸定位因子識別SpCas9很有效果。通過重組、熒光表達、電泳、測序等步驟后發(fā)現，RNase III 在protospacer（原型間隔序列）的切割過程中是不需要的，并且當RNase III 不存在的時候，89-nt tracrRNA可以被加工。同樣pre-crRNA的成熟也不需要RNase III，這證明可能有內源性RNases可以幫助crRNA前體成熟。去除任何剩余的RNA或Cas9原件會使CRISPR系統(tǒng)的基因組切割活性丟失。因此這些結果證明CRISPR有效介導基因修飾需要三個原件系統(tǒng)。接著研究者以EMX1基因座的原始間隔序列為靶標，探究真核細胞中CRISPR介導的切割效果是否具有普遍性，證明他們設計的驅動pre-crRNA和SpCas9表達載體可行性[5]。

S. Pyogenes CRISPR系統(tǒng)可以在哺乳動物細胞中的異源重組進行方便高效的基因組編輯，并證實CRISPR介導的基因靶標多種人類細胞是十分高效的。在S. Pyogenes CRISPR系統(tǒng)NGG序列的需求限制了靶標間隔（8bp），但探索Cas9家族和不同PAM的需求可以打破這些限制。事實上，其他CRISPR位點很可能被移植到哺乳動物細胞中，比如嗜熱鏈球菌 LMD-9 CRISPR1也可以介導哺乳動物基因組切割[5]。

三、CRISPR/Cas系統(tǒng)與HIV

通過高效的抗逆轉病毒可以控制HIV-1病毒的復制，這時候HIV-1病毒處于休眠狀態(tài)，稱之為潛在的前病毒，但它可能在任何時候對人體再次構成威脅。但是，以擾亂HIV-1病毒前體為目標的新技術可能從染上病毒的個體根除病毒基因組。LTR-targeting CRISPR/Cas9組件轉染HIV病毒休眠表達處或者已經誘導的T 細胞中，刺激后LTR引起有意缺失表達，從而導致HIV無法致病。通過序列分析證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效切割靶位點，并引起LTR靶位點突變。研究者成功擾亂HIV-1病毒前體的表達，Cas9蛋白有著RuvC和HNH兩個結構域，擁有自主的ssDNA切割活性，而突變體缺失RuvC和HNH其中一部分就會變成內切酶。為了抑制HIV-1 前病毒表達，TAR位點是最理想的靶基因。CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶標專一性很強，靶基因的1 個堿基發(fā)生突變都有可能導致干擾識別，這意味著一些病毒前體可能從這個基因編輯結構中逃脫。而TAR位點相對比較保守，而且在不同的HIV 病毒亞類中也基本一致。通過研究，作者等人發(fā)現CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯HIV-1基因組可以抑制其表達的潛能性[6]。

四、通過CRISPR/Cas介導的基因編輯一步設計帶有報道因子的小鼠

研究者通過共注射Cas9 mRNA、不同的sgRNA和不同大小的DNA載體進入小鼠受精卵，構建突變小鼠。通過one-step技術構建出在Nanog，Sox2、Oct4、Mecp2等基因上有熒光信號因子的突變小鼠模型。另外，用sgRNA靶標兩個獨立的位點在Mecp2基因上，使小鼠約700bp堿基缺失。從而在改造基因的小鼠和胚胎干細胞中分析5種sgRNA脫靶的可能性，并在罕見的例子中識別出脫靶突變體。采用CRISPR/Cas類型II 系統(tǒng)成功生產出了含有5 個基因突變的小鼠[7]。

在這項研究中，證明了CRISPR/Cas技術可以有效應用one-step在精確的基因底座上插入稍短的抗原決定部位或者是稍長的熒光標記，使的小鼠內生基因上帶有報告因子更加容易。在有些細胞中脫靶突變體的比例較多，有些細胞中則較少。總之，CRISPR / CAS介導的基因組編輯是一種簡單而有效的方法去構建小鼠復雜的基因突變體，比如one-step在小鼠基因上插入內生報道因子。這種方法可以應用在其他哺乳動物上，開放了更多復雜基因編輯的可能性在替他物種之間，但胚胎干細胞（ES cells）不起作用[7]。

五、運用CRISPR/Cas9構建骨髓惡性腫瘤小鼠模型

人類惡性腫瘤通常在4個或更多的驅動基因上都有突變點，用一些傳統(tǒng)的方法解釋這些基因的復雜程度是很困難的，因此可以采用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)去克服這些困難。通過構建與sgRNAs和Cas9結合的慢性病毒載體，在老鼠單個造血干細胞上改造了多達5個基因，構建出患有骨髓惡性腫瘤的模型。通過在這個載體上的一系列實驗，說明通過sgRNA：Cas9慢性病毒載體基因編輯，可以更好反應人類疾病的復雜程度[8]。

展望

ZFNs，TALENs技術已被廣泛地用于基因組定點修飾。但是目前為止，無論是ZFNs 還是TALENs 的篩選以及組裝過程都存在著較高的技術難度，并且效率較低[9]。CRISPR / CAS系統(tǒng)是一種新的可對基因組進行靶向修飾的系統(tǒng)，Cas 蛋白可以在gRNA 的引導下對外來入侵的DNA 進行定點切割，CRISPR / CAS系統(tǒng)的發(fā)現為開發(fā)更為簡易的高效基因定點修飾技術提供了嶄新的平臺。但是這個系統(tǒng)還存在著一些局限，例如CRISPR-Cas系統(tǒng)對靶基因的識別依賴于PAM元件，這就限制了其對靶基因的選擇，而且存在著脫靶效應。但隨著進一步研究這些瓶頸將會被克服?？偠灾珻RISPR / CAS，會發(fā)展成為一種操作方便、特異性強、切割效率高、并能應用于各種生物的基因組定點修飾技術。

【參考文獻】

[1]Prashant Mali，Luhan Yang，Kevin M. Esvelt，John Aach. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339，823 （2013）.

[2]Martin Jinek，Krzysztof Chylinski，Ines Fonfara，Michael Hauer. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science，2012，17 August： 816-821.

[3]Masafumi Inui，Mami Miyado，Maki Igarashi，Moe Tamano. Rapid generation of mouse models with defined point mutations by the CRISPR/Cas9 system. Science，2014，23 Jun;4：5396.

[4]Ophir Shalem，Neville E. Sanjana，Ella Hartenian，Xi Shi. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science 343，84 （2014）.

[5]Le Cong，F. Ann Ran，David Cox，Shuailiang Lin. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science，339，6121 （ 2013 ）.

[6]Hirotaka Ebina，Naoko Misawa，Yuka Kanemura & Yoshio Koyanagi. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus. Science，2013; 3：2510.

[7]Hui Yang，Haoyi Wang，Chikdu S. Shivalila，Albert W. Cheng. One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell，2013 Sep 12;154（6）.

[8]Dirk Heckl，Monika S Kowalczyk，Dad Yudovich，Roger Belizaire. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology，2014 Sep;32（9）.

[9]Wenyan Jiang，David Bikard，David Cox，Feng Zhang. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology，2013 Mar;31（3）.